長(zhǎng)治老年人群血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR C677T基因多態(tài)性

陳云霞程紅兵武延雋張雄鷹

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山西長(zhǎng)治046000)

摘要〔〕目的探討長(zhǎng)治地區(qū)健康老年人群血漿同型半胱氨酸(HCY)水平與N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因位點(diǎn)的基因多態(tài)性。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行血漿HCY水平測(cè)定；采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)對(duì)MTHFR C677T進(jìn)行基因多態(tài)性分析。結(jié)果長(zhǎng)治地區(qū)健康老年人群血漿HCY水平為(11.0±3.1)μmol/L，與健康青年人群相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。老年人群中MTHFR C677T基因的CC、CT和TT基因型頻率分別為15.38%、48.72%和35.90%，與青年人群相比，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)性(P>0.05)；老年人群C、T等位基因頻率分別為39.74%和60.26%，與青年人群相比，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTHFR C677T基因型頻率在長(zhǎng)治地區(qū)健康老年人群、青年人群中均符合Hardy-Weinberg平衡。健康老年人群MTHFR C677T位點(diǎn)各基因型間，血漿HCY水平亦無(wú)顯著差異。健康老年人群、青年人群TT基因型血漿HCY水平差異顯著(P<0.05)。結(jié)論長(zhǎng)治人群MTHFR C677T純合突變基因型頻率高，且老年人群TT基因型血漿HCY水平顯著高于青年人群。

關(guān)鍵詞〔〕同型半胱氨酸；N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R394〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2014-072)

第一作者：陳云霞(1972-)，女，碩士，副教授，主要從事基因多態(tài)性與疾病易感性研究。

同型半胱氨酸(HCY)水平的升高增加了心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是HCY代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，MTHFR C677T突變可降低酶的活性，引起血漿HCY濃度增加〔2〕。本文分析老年人群血漿HCY水平、MTHFR C677T基因多態(tài)性及兩者間的相關(guān)性，旨在為MTHFR基因突變與HCY代謝相關(guān)疾病病因研究假設(shè)提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象2009～2012年在長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院體檢的長(zhǎng)治地區(qū)健康人群中隨機(jī)選擇147例，其中老年組(年齡60～73歲)78例，青年組(年齡22～35歲)69例作為對(duì)照組。

1.2試劑與儀器Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、DL2000 DNA Marker、PCR引物合成、血液基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒(大連寶生物工程公司)；人HCY酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海微晶生物試劑有限公司)；MJ RESEARCH PTC-100基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Mj RESEARCH公司)；AlphaEase FC凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司)；DG5032酶聯(lián)免疫檢測(cè)標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.3血漿HCY水平測(cè)定研究對(duì)象均于清晨空腹抽取外周血2 ml注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，1 000 r/min離心30 min去除顆粒后于-70℃保存?zhèn)溆?。使用人HCY ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定血漿HCY水平，所有操作均按試劑盒要求進(jìn)行。

1.4基因組DNA提取采集外周血1 ml注入EDTA抗凝管中，用血液基因組DNA提取試劑盒提取。核酸樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法〔3〕擴(kuò)增含MTHFR C677T基因片段，擴(kuò)增引物為：5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′(上游)，5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′(下游)；PCR反應(yīng)體系為50 μl，其中10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μl，dNTP(各2.5 mmol/L)4 μl，DNA模板2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各4 μl，最后用雙蒸水補(bǔ)足體系；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；擴(kuò)增循環(huán)包括94℃變性1 min，53℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10 min；擴(kuò)增片段134 bp，凝膠回收后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ65℃過(guò)夜消化，酶切反應(yīng)體系為20 μl，其中10×緩沖液2 μl，凝膠回收產(chǎn)物15.5 μl，BSA 2 μl，TaqⅠ0.5 μl；酶切產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK檢驗(yàn)、Games-Howell檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。對(duì)基因型頻率在人群中的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡(H-W平衡) 吻合度檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血漿HCY水平長(zhǎng)治地區(qū)健康老年人群血漿HCY水平為(11.0±3.1)μmol/L，健康青年人群血漿HCY水平為(8.2±3.2)μmol/L，兩者無(wú)顯著差異(t=1.890，P=0.095)。

2.2H-W平衡吻合度檢驗(yàn)及MTHFR C677T基因多態(tài)性MTHFR C677T基因型頻率在健康老年人群(χ2=0.011，P=0.915)、健康青年人群(χ2=0.386，P=0.534)中均符合H-W平衡。健康老年人群、青年人群MTHFR C677T基因型頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.002，P=0.606)；健康老年人群、青年人群C、T等位基因頻率，差異無(wú)顯著性(χ2=0.732，P=0.392)。見(jiàn)表1。

2.3血漿HCY水平與MTHFR C677T多態(tài)性健康老年人群MTHFR C677T位點(diǎn)CC、CT、TT基因型血漿HCY水平經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，雙尾顯著性概率為0.656，方差齊性；單因素方差分析顯示三種基因型間HCY水平無(wú)顯著差異(P=0.340)，采用SNK法進(jìn)行均值多重比較，CC與CT、CT與TT、CC與TT基因型間的HCY水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)。健康青年人群MTHFR C677T位點(diǎn)CC、CT、TT基因型血漿HCY水平經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，雙尾顯著性概率為0.774，方差齊性；單因素方差分析顯示三種基因型間HCY水平無(wú)顯著差異(P=0.458，P>0.05)，采用SNK法進(jìn)行均值多重比較，CC與CT、CT與TT、CC與TT基因型間的HCY水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)。健康老年人群、青年人群CC基因型血漿HCY水平無(wú)顯著差異(t=0.953，P=0.368)；健康老年人群、青年人群CT基因型血漿HCY水平無(wú)顯著差異(t=1.964，P=0.085)；健康老年人群、青年人群TT基因型血漿HCY水平差異顯著(t=2.504，P=0.037)。見(jiàn)表2。

表1MTHFR C677T位基因型頻率及等位基因頻率

組別n 基因型頻率〔n(%)〕 等位基因頻率(%) CCCTTTχ2值P值CTχ2值P值老年組7812(15.38)38(48.72)28(35.90)青年組6914(20.29)37(53.62)18(26.09)1.0020.60639.7460.2647.1052.900.7320.392

組別nCCCTTT老年組789.8±2.210.9±2.711.6±2.4青年組698.0±2.98.2±3.18.3±3.11)

與老年組比較：1)P<0.05

3討論

有學(xué)者提出HCY的輕度升高本身就是致病的，或可作為相關(guān)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志〔4〕。我國(guó)人群尤其是正常人群HCY水平的研究尚不多，臨床多采用國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)〔5〕。研究結(jié)果顯示，在長(zhǎng)治地區(qū)健康育齡女性人群中，MTHFR C677T純合突變基因型頻率和突變等位基因頻率均高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道值〔6〕。本試驗(yàn)對(duì)MTHFR基因型鑒定結(jié)果仍然顯示，在長(zhǎng)治地區(qū)健康老年人群、青年人群中，MTHFR C677T純合突變基因型頻率和突變等位基因頻率均高，而接近于文獻(xiàn)報(bào)道病例組水平〔7,8〕。本試驗(yàn)MTHFR C677T基因型頻率在老年人群、青年人群中均符合H-W平衡。該組數(shù)據(jù)可為MTHFR基因突變與同型半胱氨酸代謝相關(guān)疾病病因研究假設(shè)提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。研究表明，大部分高HCY血癥可以通過(guò)補(bǔ)充葉酸、維生素B6、維生素B12減輕或糾正，MTHFR C677T的純合突變子(TT)對(duì)飲食補(bǔ)充葉酸的反應(yīng)尤為良好〔9〕。鑒于長(zhǎng)治地區(qū)人群MTHFR C677T純合突變基因型頻率高，且老年人群TT基因型血漿HCY水平顯著高于青年人群的特點(diǎn)，建議長(zhǎng)治地區(qū)人群尤其老年人群應(yīng)在飲食中適量補(bǔ)充葉酸、維生素B6、維生素B12。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-05-06修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)