老年非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液ERCC1表達(dá)與胸腔灌注順鉑聯(lián)合化療的臨床療效及預(yù)后的關(guān)系

柳志寶張菁華宋京花吳媛媛趙瑾史英高敬華

(滄州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北滄州061001)

摘要〔〕目的觀察胸腔灌注順鉑聯(lián)合化療對老年非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者胸腔積液核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)表達(dá)的影響，評價以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物的臨床療效。方法入選100例老年NSCLC伴惡性胸腔積液患者，引流胸腔積液，采用熒光定量PCR檢測ERCC1 mRNA的相對表達(dá)水平。予以胸腔內(nèi)灌注順鉑，每次40～60 mg，共2～3次，1 w內(nèi)完成，灌注期間同時給予全身化療，1個月后影像學(xué)檢測評價化療藥物的灌注療效。結(jié)果相對于管家基因β-actin，ERCC1 mRNA的相對表達(dá)水平為0.63，其水平與病理類型無相關(guān)性(P=0.118)。治療1個月后，ERCC1 mRNA高表達(dá)組治療總有效率低于低表達(dá)組(72.73% vs.91.18%，P=0.039)。1年后ERCC1 mRNA低表達(dá)組中位生存率明顯高于高表達(dá)組(10.8 vs.7.5個月，P=0.022)。結(jié)論老年NSCLC胸腔積液中ERCC1表達(dá)可作為一種評價以鉑類為基礎(chǔ)化療藥物臨床療效的生物學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕非小細(xì)胞肺癌;ERCC1;順鉑

中圖分類號〔〕R736〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：滄州市科技計劃項目〔131302047〕

通訊作者：史英(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤的綜合治療研究。

第一作者：柳志寶(1981-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性腫瘤的診療研究。

惡性胸腔積液為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)晚期最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。以順鉑為基礎(chǔ)聯(lián)合第三代化療藥物(紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱)組成的化療方案是目前治療NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但聯(lián)合化療的有效率只有30%～40%，5年生存率無明顯改善〔1,2〕。對于病理類型相同、分期相同的晚期老年NSCLC患者給予相同方案、相同劑量的化療，個體療效差異明顯，與腫瘤藥物耐藥性相關(guān)。關(guān)于順鉑耐藥的研究成為近年來的研究熱點〔3〕。核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因(ERCC)1是核苷酸切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵因子之一，其表達(dá)水平與鉑類化療藥物的療效相關(guān)〔4〕。以往研究多取材于腫瘤組織或外周血檢測ERCC1的表達(dá)，而對于肺癌伴惡性胸腔積液患者，較難獲得滿意的腫瘤組織進(jìn)行ERCC1的檢測，另外由于胸腔積液多數(shù)是由于腫瘤侵犯胸膜所致，而胸膜腔屬于相對密閉器官，腫瘤組織或外周血ERCC1的表達(dá)尚不能完全替代胸腔積液中ERCC1的表達(dá)，因此留取胸腔積液進(jìn)行ERCC1的檢測可能對化療藥物療效的預(yù)測更為敏感。本實驗前瞻性觀察胸腔內(nèi)灌注順鉑聯(lián)合化療方案對老年NSCLC患者胸腔積液中ERCC1表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1研究對象2011年10月至2012年12月我科收治老年NSCLC患者100例，平均年齡(71.56±18.54)歲，男68例，女32例。所有患者均經(jīng)支氣管鏡下活檢或穿刺活檢獲得病理學(xué)診斷，鱗癌32例，腺癌63例，其他5例。所有患者均完善血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、心電圖、胸片等檢查。

1.2試劑與儀器PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，3K30超速冷凍離心機(美國Sigma公司)，Rotor-Gene Q型實時熒光定量PCR儀(上海Qiagen公司)。

1.3治療方法所有患者經(jīng)CT或超聲定位后無菌條件下行胸腔穿刺置管閉式引流術(shù)，置入單腔中心靜脈導(dǎo)管，間斷負(fù)壓引流，盡量在24 h內(nèi)排凈胸腔積液。予以胸腔內(nèi)灌注順鉑，每次注入40～60 mg，共2～3次，1周內(nèi)完成，每次灌注完畢后囑患者變換體位30 min，灌注治療期間同時給予全身化療，以第三代化療藥物吉西他濱、紫杉醇、長春瑞濱為主。1個月后影像學(xué)評價化療藥物的灌注療效，療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照WHO標(biāo)準(zhǔn)，即：完全緩解(CR)：經(jīng)治療后胸腔積液完全吸收，癥狀消失，至少維持30 d以上；部分緩解(RR)：經(jīng)治療后胸腔積液顯著減少在50%以上，癥狀改善，并維持30 d以上不需要抽液者；無效(NC)：經(jīng)治療后胸腔積液減少不足50%或治療后30 d內(nèi)必須再抽液者；進(jìn)展(PD)：治療后胸腔積液顯著增加或患者死亡。有效率(RR)=CR+PR。

1.4ERCC1測定①收集胸腔積液1 000 ml，加入20 000 U肝素抗凝，將胸水13 000 r/min離心1 min，棄去上清液，收集管底細(xì)胞。②將收集到的細(xì)胞重懸，加入900 μl Cell Lysis Solution，室溫孵育10 min，13 000 r/min室溫離心20 s，棄去部分紅色上清液，重懸白色沉淀。③加入300 μl Nuclei Lysis Solution，混勻，再加入100 μl Protein Precipitation Solution，劇烈振蕩20 s，13 000 r/min室溫離心3 min。④取上清液至新的已滅菌1.5 ml EP管中，加入300 μl異丙醇，蓋上管蓋，上下顛倒混勻，可見白色絮狀DNA析出，13 000 r/min室溫離心1 min，棄上清。加入300 μl 70%乙醇，輕柔上下顛倒洗滌沉淀，13 000 r/min室溫離心1 min，棄上清，吸干殘留液體。⑤樣本PCR產(chǎn)物電泳：ERCC1 C19007T/C8092A產(chǎn)物片段大小在200 bp內(nèi)，配制100 ml、2%瓊脂糖凝膠，計算瓊脂糖的用量和制膠 TAE緩沖液的用量后，制備瓊脂糖凝膠，按100 V，30 min進(jìn)行電泳，在成像系統(tǒng)中得到圖像。⑥加入100 μl DNA Rehydration Solution至沉淀，進(jìn)行PCR擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性15 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)，包括95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s。⑦焦磷酸測序，進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5隨訪1年后對所有100例患者進(jìn)行隨訪，記錄主要不良事件發(fā)生情況，包括胸腔積液復(fù)發(fā)、腫瘤新發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡等。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以中位數(shù)表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，Spearman相關(guān)性分析基因表達(dá)量與病理類型之間的關(guān)系，單因素生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier曲線。

2結(jié)果

2.1胸腔積液ERCC1表達(dá)水平檢測的100例老年NSCLC患者中，ERCC1相對管家基因β-actin RNA的相對表達(dá)水平為0.63(0.005～1.143)，以ERCC1 mRNA中位相對表達(dá)水平0.63為界，分為ERCC1 mRNA高表達(dá)組(≥0.63)66例和ERCC1 mRNA低表達(dá)組(<0.63)34例。ERCC1 mRNA高表達(dá)組鱗癌17例(25.76%)，腺癌47例(71.21%)，其他類型2例(3.03%)，ERCC1 mRNA低表達(dá)組鱗癌9例(26.47%)，腺癌24例(70.59%)，其他類型9例(2.9%)，ERCC1 mRNA表達(dá)水平與病理類型未見明顯差異(P=0.118)。

2.2兩組療效比較胸腔灌注順鉑聯(lián)合化療治療1個月后，ERCC1 mRNA高表達(dá)組治療總有效率為72.73%CR23例(34.85%)，PR25例(37.88%)，NC13例(19.7%)，PD1例(2.94%)，低表達(dá)組治療總有效率為91.18%，CR14例(41.18%)，PR17例(50.00%)，NC2例(5.89%)，PD1例(2.94%)，低表達(dá)組總有效率高于高表達(dá)組(P=0.039)。

2.3ERCC1 mRNA表達(dá)水平與老年NSCLC患者生存的關(guān)系100例老年NSCLC患者中位生存率為8.7個月，經(jīng)胸腔灌注順鉑聯(lián)合化療后ERCC1 mRNA低表達(dá)組的中位生存率明顯高于ERCC1 mRNA高表達(dá)組(10.8 vs.7.5個月，P=0.022，見圖1)。

圖1　老年NSCLC患者生存期曲線

3討論

NSCLC占肺癌總數(shù)的80%左右，病情發(fā)生、發(fā)展較為隱匿，當(dāng)臨床癥狀、體征較為明顯而被患者察覺后多數(shù)已經(jīng)發(fā)展到Ⅲ期或Ⅳ期〔5，6〕，常引起惡性胸腔積液，手術(shù)切除率低、預(yù)后差，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量及生存期。

以順鉑為基礎(chǔ)聯(lián)合第三代化療藥物(紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱)組成的化療方案是目前治療NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但有效率仍然很低。研究表明，即便給予順鉑化療方案、給藥劑量相同，臨床療效也可產(chǎn)生很大差異〔7，8〕，這種差異主要取決于順鉑的耐藥性問題。順鉑抗癌作用的主要靶點為DNA雙鏈中鳥嘌呤的N7位點，作用時通過DNA-Pt-DNA結(jié)構(gòu)形成DNA鏈間內(nèi)部交聯(lián)、鏈間交聯(lián)或通過DNA-Pt-蛋白形成DNA-蛋白交聯(lián)，破壞DNA正常結(jié)構(gòu)，阻礙DNA的模板作用，從而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程〔9〕。既往實驗發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)DNA損傷修復(fù)能力增強時可導(dǎo)致其對順鉑產(chǎn)生耐藥性，DNA損傷修復(fù)主要通過核苷酸切除修復(fù)途徑進(jìn)行，而ERCC1在核苷酸剪切修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用〔10,11〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，老年NSCLC患者胸腔積液中ERCC1 mRNA的相對表達(dá)水平為0.63，證明ERCC1 mRNA相對表達(dá)水平升高可能參與順鉑抗藥性過程，但ERCC1 mRNA表達(dá)水平與病理類型未見明顯相關(guān)，表明ERCC1基因的啟動表達(dá)不依賴于NSCLC病理類型。ERCC1 mRNA低表達(dá)組治療總有效率高于ERCC1 mRNA高表達(dá)組(P=0.039)，這表明胸腔灌注順鉑聯(lián)合化療方案對老年NSCLC患者具有較好的臨床治療效果，安全有效，臨床上值得推廣應(yīng)用。且ERCC1 mRNA低表達(dá)組中位生存率明顯高于高表達(dá)組，故胸腔積液中ERCC1可能作為一種生物學(xué)標(biāo)記物用以評價患者預(yù)后。

4參考文獻(xiàn)

1Friboulet L,Barrios-Gonzales D,Commo F,etal.Molecular characteristics of ERCC1-negative versus ERCC1 positive tumors in resected NSCLC 〔J〕. Clin Cancer Res,2011;17(17):5562-72.

2李惠，張樹鵬，謝玲，等.非小細(xì)胞肺癌組織中EGFR基因突變與ERCC1基因表達(dá)的關(guān)系〔J〕. 山東醫(yī)藥，2012;52(6)：67-8.

3鞠放，汪青，清水汪，等.晚期非小細(xì)胞肺癌p53和ERCC1表達(dá)狀態(tài)與順鉑為主的聯(lián)合方案化療的近期有效率的相關(guān)性研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012;5(12)：876-9.

4Ozdemir O,Ozdemir P,Veral A,etal.ERCC1 expression does not predict survival and treatment response in advanced stage non-small cell lung cancer cases treated with platinum based chemotherapy 〔J〕. Asian Pac J Cancer Prev,2013;14(8):4679-83.

5田昕，李寧.ERCC1介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥研究進(jìn)展〔J〕. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012;4(35)：355-7.

6史席靜.胸腔灌注奈達(dá)鉑治療非小細(xì)胞肺癌惡性胸腔積液療效觀察〔J〕. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014;23(21)：2364-6.

7叢瑩瑩，劉美艷，蔡莉，等.胸腔灌注奈達(dá)鉑與順鉑治療非小細(xì)胞肺癌惡性胸腔積液的療效比較〔J〕. 中華腫瘤雜志，2010;32(6)：467-9.

8任劍，呂賽平，徐炎良.非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)ERCC1與順鉑耐藥的相關(guān)性分析〔J〕. 江西醫(yī)藥，2014;49(3)：194-6.

9董云，李志革.ERCC1、BRCA1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)與順鉑耐藥的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤學(xué)，2010;5(18)：1037-40.

10陳佳，譚清和.ERCC1在非小細(xì)胞肺癌個體化治療中的研究進(jìn)展〔J〕.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2012;32(2)：150-3.

11華之卉，房之錚，趙忠全，等.ERCC1和ERCC4基因多態(tài)性對NSCLC患者順鉑療效的影響〔J〕. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011;16(7)：772-8.

〔2014-03-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)