高海拔地區(qū)大腸癌中nm23、ki67的表達(dá)及臨床意義

才保加祁玉娟1

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，青海西寧810001)

摘要〔〕目的探討高海拔地區(qū)大腸癌nm23、ki67的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法用免疫組織化學(xué)Elivision plus法，測(cè)定90例大腸癌(觀察組)及37例癌旁組織(對(duì)照組)中nm23、ki67的表達(dá)。結(jié)果兩組nm23、ki67的陽(yáng)性表達(dá)率差異顯著；nm23、ki67的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論聯(lián)合檢測(cè)大腸癌中nm23、ki67的表達(dá),有利于更好地評(píng)估大腸癌的生物學(xué)行為,綜合其他臨床檢查可對(duì)患者治療及預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕大腸癌;免疫組化;nm23;ki67

中圖分類號(hào)〔〕R737.9〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1青海省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

第一作者：才保加(1971-)，男，副主任醫(yī)師， 主要從事胃腸外科研究。

大腸癌發(fā)病與患者的飲食結(jié)構(gòu)、慢性炎癥、大腸腺瘤、吸煙等關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)探討高海拔地區(qū)大腸癌組織中nm23和ki67表達(dá)及其對(duì)診斷及預(yù)后的價(jià)值。

1資料與方法

1.1臨床資料2012年1月至2014年12月我院91例大腸癌患者為觀察組，均經(jīng)病理確診，均為本地患者(居住海拔在2 200 m左右)。年齡35～72歲，中位年齡58歲；距離腫瘤邊緣3 cm以上5 cm之內(nèi)取癌旁組織37例為對(duì)照組。

1.2檢測(cè)試劑及步驟nm23檢測(cè)均采用鼠源單克隆抗體Anti-Nm23-H1抗體,腫瘤抑制基因一抗，ki67檢測(cè)采用Elivision plus試劑盒，所有試劑盒均來(lái)源于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。樣本經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋后進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片4張，脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每張切片加1滴一抗，室溫下孵育60 min，PBS再次沖洗后，加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育30 min，PBS再次沖洗后，加1滴酶標(biāo)抗，室溫下孵育30 min，PBS再次沖洗后，加1滴新鮮配制的DAB溶液，蘇朩素復(fù)染，PBS反藍(lán)；切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，采用中性樹膠封固，整個(gè)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定采用典型的nm23、ki67大腸癌陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液替代一抗檢測(cè)的標(biāo)本作為陰性對(duì)照，所有檢測(cè)結(jié)果均由3位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估。nm23陽(yáng)性結(jié)果反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色，陰性結(jié)果為淺藍(lán)色； ki-67 陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色，陰性結(jié)果為藍(lán)色。按染色強(qiáng)度記分:棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淺黃色計(jì)1分，無(wú)色計(jì)0分，染色強(qiáng)度的評(píng)估充分與陰、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比；每張切片至少觀察5個(gè)視野(400×)，計(jì)算染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)及陽(yáng)性細(xì)胞百分比平均值。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥2 則判斷為陽(yáng)性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1nm23、ki67在各組織的表達(dá)與對(duì)照組比較nm23、ki67陽(yáng)性表達(dá)〔27(72.9%)、8(21.6%)〕，觀察組nm23、ki67陽(yáng)性表達(dá)有顯著差異〔42(46.2%)、56(61.5%)，(P<0.01)〕

2.2nm23、ki67在大腸癌組織免疫組化染色結(jié)果nm23 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色染色。ki67陽(yáng)性反應(yīng)為棕褐色、顆粒狀，定位于細(xì)胞核。nm23、ki67在大腸癌組織的表達(dá)見圖1。

圖1　觀察組nm23、ki67免疫組化結(jié)果(×400)

2.3nm23、ki67在不同臨床特征陽(yáng)性表達(dá)比較nm23和Ki67的陽(yáng)性表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化、大體類型、部位之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的nm23陽(yáng)性表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者的ki67陽(yáng)性表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者(P<0.05)；Dukes C、D期患者的ki67陽(yáng)性表達(dá)明顯高于Dukes A、B期(P<0.05)。見表1。

表1　nm23、ki67與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系〔 n(%)〕

與Dukes C、D期比較：1)P<0.05；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較：2)P<0.05

3討論

腫瘤遺傳學(xué)是遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)之間的邊緣學(xué)科，著重研究惡性腫瘤的發(fā)生與遺傳關(guān)系。主要包括三方面的研究?jī)?nèi)容：①惡性腫瘤易患性的遺傳背景。②遺傳物質(zhì)的變化或遺傳信息表達(dá)的異常同惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系。③以遺傳學(xué)的方法分析環(huán)境中導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的因素。腫瘤遺傳學(xué)的研究不僅可以為腫瘤的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)，也可以為惡性腫瘤的診斷和防治提供線索。目前有4種關(guān)于腫瘤發(fā)生的遺傳機(jī)制的假說(shuō)：即染色體不平衡假說(shuō)認(rèn)為染色體異常是癌變的原初變化，各種因素造成細(xì)胞的不對(duì)稱分裂而使子細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)分布不平衡，從而影響基因的正常功能，是腫瘤發(fā)生的原因。兩次突變假說(shuō)認(rèn)為基因第一次突變是腫瘤的始動(dòng)過(guò)程，第二次突變是促進(jìn)過(guò)程；兩次突變假說(shuō)已被不少學(xué)者接受并不斷地予以修改和補(bǔ)充，可用于解釋各種遺傳型和非遺傳型腫瘤形成的機(jī)制。轉(zhuǎn)化基因假說(shuō)認(rèn)為正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞是由一種所謂轉(zhuǎn)化基因(Tr)所決定的，正常情況下轉(zhuǎn)化基因被調(diào)節(jié)基因i+Tr所阻遏，i+Tr基因經(jīng)突變成為突變型基因i0Tr，在純合體i0Tr/i0Tr中Tr基因消除阻遏而被激活，于是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。癌基因假說(shuō)認(rèn)為在人和動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源的DNA順序，稱為原癌基因，這些基因在正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性較低或雖有轉(zhuǎn)錄但對(duì)細(xì)胞無(wú)害，原癌基因被活化成為癌基因后便大量轉(zhuǎn)錄，或者發(fā)生突變后便轉(zhuǎn)錄出異常產(chǎn)物，這兩種情況都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變。

本研究結(jié)果可見nm23對(duì)于癌癥的發(fā)展應(yīng)該是有一定的作用，自1988年nm23基因被發(fā)現(xiàn)其在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞中表達(dá)是高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的10倍，而被作為第一個(gè)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因，目前關(guān)于人nm23家庭已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少10個(gè)亞型，而且nm23低表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)〔1～4〕。但是關(guān)于nm23表達(dá)在不同腫瘤之間并沒有一致性結(jié)論，這可能與癌癥的類型、特異性抗體及免疫組化法中的計(jì)分方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，而且有研究發(fā)現(xiàn)nm23在原發(fā)性癌癥早期是增加的，但發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移后nm23的水平才降低，可見nm23的表達(dá)在癌癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)變化〔5〕。而且nm23的表達(dá)在原發(fā)性癌癥中變化由于nm23基因不穩(wěn)定造成的〔6〕。在細(xì)菌和低級(jí)真核細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，nm23作為磷酸組氨酸能夠作用于組氨酸蛋白激酶和組氨酸激酶信號(hào)傳遞過(guò)程，保證細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)的磷酸傳遞處于平衡狀態(tài)〔7，8〕。初始下降nm23-H1水平可以進(jìn)一步促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。nm23-H1表達(dá)3′5′核酸外切酶活性可能參與DNA修復(fù)，降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移，如果nm23表達(dá)減少，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞逃避凋亡〔9，10〕。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵的特性，Ki67作為一種細(xì)胞核抗原，在乳腺癌的研究中較為廣泛，通過(guò)動(dòng)態(tài)的Ki67表達(dá)水平監(jiān)測(cè)，對(duì)于癌癥的預(yù)測(cè)、預(yù)防等都具有重要意義〔11～15〕，與nm23一樣，最常用評(píng)估Ki67的方法主要是免疫組織化學(xué)，由于多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的方法不一致，盡管明確ki67水平監(jiān)測(cè)的重要意義，但是常規(guī)使用的腫瘤生物標(biāo)志物還沒有得到普遍共識(shí)，標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法統(tǒng)一，結(jié)果可靠性較差〔16〕， ki67影響腫瘤的確切機(jī)制目前尚不明確，但大量的研究已經(jīng)證實(shí)ki67的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展具有明顯的相關(guān)性，由此認(rèn)為ki67可能是通過(guò)染色質(zhì)來(lái)加速細(xì)胞分裂，使腫瘤細(xì)胞的增殖失控，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，具有更高的侵襲性，轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)明顯增高，導(dǎo)致患者預(yù)后更差。

綜上，nm23和ki67與大腸癌的發(fā)生和發(fā)展都有明顯的相關(guān)性，但沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此不宜將該檢測(cè)指標(biāo)作為評(píng)估腫瘤的唯一標(biāo)準(zhǔn)，而應(yīng)該對(duì)各項(xiàng)檢查進(jìn)行綜合分析。

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〔2014-03-19修回〕

(編輯苑云杰)