VEGF、MMP-2和TNF-α在子宮肌瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

張冬紅牛建清1楊素梅

(唐山市開(kāi)灤(集團(tuán))有限責(zé)任公司唐家莊醫(yī)院，河北唐山063100)

摘要〔〕目的檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和腫瘤壞死因子 (TNF)-α在人子宮肌瘤中的表達(dá)，探討其在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。方法取2013年1～12月該院收治的54例子宮肌瘤患者的子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織，分別采用免疫組化法測(cè)定雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達(dá)，采用RT-PCR法測(cè)定VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA的表達(dá)，比較子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織表達(dá)的差異，并且分析ER、PR與VEGF、MMP-2、TNF-α 表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果(1)子宮肌瘤組織ER和PR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.52%和75.93%，均顯著高于正常子宮肌組織(P<0.05或P<0.01)；(2)子宮肌瘤組織中VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)水平均較正常子宮肌組織顯著升高(P<0.01)；(3)ER(+)和PR(+)子宮肌瘤組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)較ER(-)和PR(-)子宮肌瘤組織均顯著升高(P<0.01)；(4)相關(guān)性分析顯示，ER、PR表達(dá)評(píng)分均與VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論VEGF、MMP-2和TNF-α在子宮肌瘤均高表達(dá)，在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并且ER和PR的高表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕子宮肌瘤；腫瘤壞死因子-α；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省科學(xué)技術(shù)廳課題(20132924)

1開(kāi)灤總醫(yī)院

第一作者：張冬紅(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病研究。

子宮肌瘤多數(shù)患者進(jìn)展緩慢，少數(shù)可發(fā)生變性、壞死，或發(fā)展為惡性腫瘤〔1〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其為激素依賴性腫瘤，組織局部雌激素合成和代謝異常導(dǎo)致雌激素堆積是雌激素依賴性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因〔2〕。隨著對(duì)子宮肌瘤研究的不斷深入，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和腫瘤壞死因子(TNF)-α也可能參與子宮肌瘤的形成。本實(shí)驗(yàn)探討VEGF、MMP-2和TNF-α 在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用以及與雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的相互作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源2013年1～12月本院收治的子宮肌瘤患者54例納入本次研究。年齡50～78歲，平均(67.43±8.75)歲，均出現(xiàn)月經(jīng)量增多，經(jīng)期延長(zhǎng)，下腹部硬塊或下腹部疼痛、壓迫等癥狀及體征。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>50歲；(2)絕經(jīng)1年或以上；(3)病理學(xué)確診為子宮肌瘤；(4)接受子宮肌瘤切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前近3個(gè)月服用激素類(lèi)藥物；(2)嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟疾病患者。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且所有患者均知情同意。子宮肌瘤組織標(biāo)本取自子宮肌瘤中心與肌瘤邊緣連線中間處，子宮肌組織取自子宮肌瘤旁1 cm以外，各組織樣本分別以0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小置于Enpendof管中，部分放入液氮罐保存，另外組織樣本置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。

1.2主要試劑ER和PR抗體均由英國(guó)Abcam公司提供；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、濃縮型DAB 試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自北京中杉公司；RNA提取試劑，美國(guó)Invitrogen公司提供；BCA試劑盒，美國(guó)IMerce公司提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Promega公司提供。VEGF、TNF-α、MMP-2和內(nèi)參β-actin引物均由上海鼎安生科科技有限公司合成。引物：VEGF：正義：5'-TGCAGATTATGCGGATCAAA CC-3'、反義：5'-TGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度81 bp；TNF-α正義：5'-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGA-3'、反義：5'-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度367 bp；MMP-2正義：5'-CGCTCAGATCCGTGGTGAGAT-3'、反義：5'-CGGGAGCTCAGGCCAGAATG-3'，218 bp；β-actin正義：5'-ACCAACTGGGACGACATGGACAAA-3'、反義：5'-ACTCCTGCT TGCTGATCCACATCT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度187 bp。

1.3免疫組化法測(cè)定ER和PR的表達(dá)常規(guī)石蠟包埋切片3～4 μm，石蠟切片用二甲苯脫蠟至去離子化，乙二胺四乙酸修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原高壓熱修復(fù)，打孔劑洗滌后采用3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，PBS洗滌后分別滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌加入二抗37℃孵育30 min，PBS 洗滌，DAB顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。ER或PR陽(yáng)性判斷采用Sinicrope 改良法：根據(jù)切片中染色細(xì)胞計(jì)數(shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，表達(dá)評(píng)分= 染色細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分× 染色強(qiáng)度評(píng)分，表達(dá)評(píng)分<1 分為陰性結(jié)果，2～3 分為弱陽(yáng)性，4～5 分為中度陽(yáng)性，>5 分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4PT-PCR法測(cè)定VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA的表達(dá)取0.1 g 組織加入1 ml Trizol 試劑按照說(shuō)明書(shū)提取試劑盒制備總RNA。取RNA樣品，用核酸分析儀進(jìn)行定量，測(cè)定260 nm和280 nm的吸光度(A)值，控制A260/A280在1.9～2.1。用2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 質(zhì)量，立即用于cDNA 合成。PCR反應(yīng)體系共25 μl：ddH2O 16.25 μl，10×PCR-Buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 2.5 μl，Taq酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR GreenI 0.25 μl，cDNA 2 μl。RT-PCR按照SYBR Green PCR Reagents說(shuō)明書(shū)應(yīng)用7500 Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，結(jié)果用凝膠自動(dòng)成像2000系統(tǒng)掃描，使用基于內(nèi)參物β-actin的相對(duì)定量分析，目的基因mRNA表達(dá)量用2-⊿⊿Ct計(jì)算。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0軟件，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1子宮肌瘤和正常子宮肌組織ER和PR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較子宮肌瘤組織ER陽(yáng)性率為68.52%；PR陽(yáng)性率為75.93%，正常子宮肌組織ER陽(yáng)性率44.44%，PR陽(yáng)性率為40.74%，子宮肌瘤組織均顯著高于正常子宮肌組織(χ2=6.366，P=0.012，χ2=13.752，P=0.000)。見(jiàn)表1。

表1　子宮肌瘤和正常子宮肌組織ER和PR蛋白陽(yáng)性率表達(dá)的比較〔 n(%), n=54〕

2.2子宮肌瘤和正常子宮肌組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)水平比較子宮肌瘤組織中VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)水平均較正常子宮肌組織顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　子宮肌瘤和正常子宮肌組織VEGF、MMP-2和

2.3ER(+)和ER(-)子宮肌瘤組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)的比較ER(+)子宮肌瘤組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)較ER(-)子宮肌瘤組織顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　ER(+)和ER(-)子宮肌瘤組織VEGF、

2.4PR(+)和PR(-)子宮肌瘤組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)的比較PR(+)子宮肌瘤組織VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表達(dá)較PR(-)子宮肌瘤組織顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4　PR(+)和PR(-)子宮肌瘤組織VEGF、

2.5子宮肌瘤組織ER、PR表達(dá)評(píng)分與VEGF、MMP-2、TNF-α mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析ER、PR表達(dá)評(píng)分均與VEGF(r=0.427、0.512)、MMP-2(r=0.573、0.589)和TNF-α mRNA(0.627、0.652)表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.01)。

3討論

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，子宮肌瘤是女性生殖器官中最常見(jiàn)的良性腫瘤，是影響婦女生殖健康的常見(jiàn)病及多發(fā)病，并且是導(dǎo)致不孕、月經(jīng)失調(diào)及子宮切除的主要原因。據(jù)報(bào)道，育齡婦女中其發(fā)病率高達(dá)25%～40% ，年齡>40 歲的婦女約有50% 患有子宮肌瘤〔3〕。該疾病發(fā)病初期多無(wú)顯著臨床癥狀，隨病情發(fā)展可表現(xiàn)出月經(jīng)過(guò)多、下腹部包塊或排尿、排便困難等臨床表現(xiàn)〔4〕。子宮肌瘤雖然絕大多數(shù)子宮肌瘤呈現(xiàn)良性，但也有少數(shù)產(chǎn)生惡變。

子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程，其病因尚未十分明確，目前的資料表明子宮肌瘤是甾體激素依賴性腫瘤，子宮肌瘤的生長(zhǎng)依賴于卵巢固醇類(lèi)雌孕激素，與基因、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑異常及細(xì)胞因子等多種因素有關(guān)〔5〕。近來(lái)研究表明孕激素對(duì)子宮肌瘤更有促生長(zhǎng)作用〔6〕。雌激素、孕激素分別通過(guò)ER、PR 發(fā)揮生物學(xué)作用。ER、PR 與雌、孕激素有較高的親和力，選擇性保留較高濃度的雌、孕激素，從而使其生物學(xué)效應(yīng)加強(qiáng)〔7〕。本研究結(jié)果再次說(shuō)明ER和PR在子宮肌瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。

VEGF是一種糖基化多肽性分泌因子，是由兩個(gè)相同亞基以二硫鍵交聯(lián)結(jié)合而成、具有高度保守性的同源二聚體糖蛋白〔8〕。VEGF為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，直接刺激血管生成，是刺激腫瘤血管發(fā)生、血管重塑、血管芽生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子〔9〕。本研究結(jié)果說(shuō)明VEGF在子宮肌瘤組織中呈高表達(dá)。雌激素和孕激素通過(guò)VEGF受體介導(dǎo)能調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，參與子宮肌瘤內(nèi)皮增生及血管生成的局部因子以VEGF表達(dá)最強(qiáng)，VEGF還可增加血管通透性，為血管形成過(guò)程中多種細(xì)胞遷移提供纖維網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)肌瘤生長(zhǎng)。VEGF mRNA表達(dá)與ER和PR高表達(dá)相關(guān)。

隨著對(duì)子宮肌瘤研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)MMPs 家族促進(jìn)血管基底膜的降解，導(dǎo)致的結(jié)果包括血管通透性增加、血管壁完整性受損，導(dǎo)致下游VEGF 釋放增加，參與子宮平滑肌瘤的發(fā)病過(guò)程。MMP-2是一種非糖化、分子量為72 kD的明膠酶，由許多結(jié)締組織細(xì)胞分泌，主要降解I、Ⅱ、Ⅲ型明膠，以及Ⅳ、V、Ⅶ、X型膠原與纖粘連蛋白、彈性蛋白〔10〕。所有靠大量ECM重構(gòu)的過(guò)程都可能涉及MMP-2，從而破壞細(xì)胞周?chē)腅CM框架，進(jìn)而影響到細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的分化和增生〔11〕。另一方面，MMP-2還激活其他MMPs，使蛋白溶解原酶轉(zhuǎn)變成酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使子宮平滑肌腫瘤得以進(jìn)一步生長(zhǎng)。本研究結(jié)果說(shuō)明MMP-2在子宮肌瘤組織中呈高表達(dá)，MMP-2 mRNA表達(dá)與ER和PR高表達(dá)相關(guān)。

近年來(lái)TNF-α作為炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子倍受重視，被活化的吞噬細(xì)胞可釋放大量TNF-α，使局部平滑肌組織細(xì)胞損傷及增生病變加劇，形成正反饋炎癥病理?yè)p傷效應(yīng)。此外，TNF-α可通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)間接發(fā)揮血管形成作用,以及誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，從而參與疾病的發(fā)生〔12〕。已有研究〔13〕顯示，TNF-α在肌瘤中表達(dá)高于鄰近肌層，可能與炎癥產(chǎn)物刺激單核吞噬細(xì)胞分泌TNF-α以及肌瘤細(xì)胞自分泌TNF-α有關(guān)。本研究結(jié)果說(shuō)明TNF-α在子宮肌瘤組織中呈高表達(dá)，與上述研究一致。此外，TNF-α mRNA表達(dá)與ER和PR高表達(dá)相關(guān)。

總之，VEGF、MMP-2和TNF-α在子宮肌瘤均高表達(dá)，在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并且ER和PR的高表達(dá)相關(guān)。

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〔2014-03-15修回〕

(編輯徐杰)