低氧對(duì)無(wú)糖逆境中星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的作用

李詠梅敖麗娟吳國(guó)瑞趙寧輝黃曉瑋1徐蔚

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南昆明650101)

摘要〔〕目的探討星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)低氧的耐受程度；葡萄糖對(duì)其凋亡和增殖的影響及無(wú)糖逆境中低氧微環(huán)境對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的是否具有保護(hù)作用及可能分子機(jī)制。方法通過(guò)三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建低氧微環(huán)境，將星形膠質(zhì)細(xì)胞(HAC)設(shè)為常氧常糖組(21%O2-G+)和常氧無(wú)糖組(21%O2-G-)，低氧常糖組(0.1%O2-G+)和低氧無(wú)糖組(0.1%O2-G-)。分別在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24、48、72 h后通過(guò)MTT法及AnnexinV-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況，利用Western印跡法檢測(cè)各組低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α表達(dá)情況。結(jié)果在低氧常糖組星形膠質(zhì)細(xì)胞各時(shí)間段無(wú)明顯凋亡(P>0.05)，但可緩慢增殖。常氧無(wú)糖組及低氧無(wú)糖組48 h細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生明顯凋亡，增殖被顯著抑制(P<0.05)，48 h低氧無(wú)糖組細(xì)胞凋亡明顯低于常氧無(wú)糖組(P<0.05)，至72 h凋亡率高于常氧無(wú)糖組(P<0.05)。低氧可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)水平增高，其中低氧常糖組HIF-1α表達(dá)水平最高，其次為低氧無(wú)糖組，常氧常糖及常氧無(wú)糖組表達(dá)量均較低。結(jié)論星形膠質(zhì)細(xì)胞可耐受極度低氧；葡萄糖缺乏可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡并抑制其增殖；低氧可在一定時(shí)限內(nèi)部分對(duì)抗葡萄糖缺乏所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。低氧可誘導(dǎo)HIF-1α的高表達(dá)，并且可能與低氧抗無(wú)糖逆境作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕低氧；葡萄糖；腦膠質(zhì)細(xì)胞；凋亡；低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R743.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060208)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30660190)

通訊作者：徐蔚(1962-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事腦損傷研究。

1云南大學(xué)

第一作者：李詠梅(1975-)，女，博士，講師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

Effect of hypoxia on astrocytes apoptosis in glucose-deprivation adversity

LI Yong-Mei,AO Li-Juan,WU Guo-Rui,etal.

Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming650101,Yunnan, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the astrocytes tolerance to hypoxia microenvironment, the influence of glucose and glucose-free circumstances on astrocytes apoptosis and proliferation and whether hypoxia has the capacity of protection of astrocytes against apoptosis for glucose deprivation.MethodsThree gas incubator was employed to construct hypoxic micro-environment, then astrocyte (HAC cell-line)was placed in different cultured condition respectively at the same time: normaxia-glucose (21%O2-G+), normoxia glucose-free (21%O2-G-), hypoxia-glucose (0.1%O2-G+)and hypoxia glucose-free (0.1%O2-G-)for 24, 48, 72 h. By MTT method and Annexin V-FITC/PI staining cells to investigate cell proliferation and apoptosis at the corresponding time. Western blot method was used to detect HIF-1α expression level in the different condition. Compare the apoptosis and proliferation of astrocytes in different condition and the expression level of HIF-1α.ResultsThere were not obvious apoptosis when the oxygen concentration was very extremely low but in the presence of glucose (P>0.05). Moreover, the cells proliferated slowly. But glucose deprivation independently induced the apoptosis of the astrocytes and suppressed the proliferation rate of them. Whereas hypoxia decreased the effect of glucose deprivation(P<0.05). The hypoxia induced high level expression of HIF-1α protein. Under the condition of hypoxia at the presence of glucose, the expression level of HIF-1α was the most high.ConclusionsAstrocytes could tolerate extremely low oxygen. Glucose deprivation could independently induce the apoptosis and suppress the proliferation of the HAC. Hypoxia could decrease the apoptosis of the cells which glucose deprivation induced. The expression of HIF-1α could be induced by hypoxia. The expression of HIF-1αmay be associated with the effect of hypoxia anti-glucose deprivation adversity.

【Key words】Hypoxia; Glucose-deprivation；Astrocytes ; Apoptosis；HIF-1α

星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)還原性谷胱甘肽(GSH)及紅細(xì)胞生成素(EPO)的作用，保護(hù)神經(jīng)元免于細(xì)胞毒性作用及氧化損傷，對(duì)維持神經(jīng)元的生存微環(huán)境起著非常重要的作用〔1～3〕。在缺血性腦損傷中，周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞存活是神經(jīng)元存活的必要條件〔4〕。目前研究發(fā)現(xiàn)預(yù)缺血可通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的介導(dǎo)提高腦的缺氧耐受能力〔5，6〕。但低氧也可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度的增生，并產(chǎn)生一些有害的生物活性物質(zhì)，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和功能障礙，形成膠質(zhì)瘢痕作為機(jī)械屏障影響髓鞘和軸索的再生，從而影響周?chē)窠?jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)，最終影響神經(jīng)元存活〔7〕。葡萄糖是腦內(nèi)主要的能量物質(zhì)來(lái)源，在低氧狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)糖酵解來(lái)提供所需的能量〔8，9〕。在大部分的腦損傷中，缺血缺氧同時(shí)伴葡萄糖的缺乏是常見(jiàn)的病理生理狀態(tài)〔10，11〕。已有大量的研究證實(shí)缺氧及葡萄糖剝奪可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能受損并發(fā)生死亡，但對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞耐受低氧的程度及時(shí)限以及葡萄糖缺乏對(duì)其在常氧和低氧下凋亡和增殖的影響的差異，低氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)無(wú)糖逆境中的作用及可能機(jī)制尚未清晰闡明。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α可能具有抗凋亡和促凋亡的雙重作用，在不同的細(xì)胞種類(lèi)及其所處的特定微環(huán)境(如低氧環(huán)境)，HIF-1α所調(diào)節(jié)的促凋亡因子和抗凋亡因子之間存在一種錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡關(guān)系，從而導(dǎo)致對(duì)凋亡過(guò)程的不同調(diào)控結(jié)果〔12～14〕。本研究探討腦星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)低氧的耐受程度，葡萄糖對(duì)其凋亡和增殖的影響及無(wú)糖逆境中低氧微環(huán)境對(duì)腦膠質(zhì)細(xì)胞的是否具有保護(hù)作用及可能分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組將人小腦星形膠質(zhì)細(xì)胞株HAC(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院)，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/高糖+10%FBS+1%P/S，均購(gòu)自Gibco)培養(yǎng)24 h，設(shè)為常氧常糖對(duì)照組(21%O2-G+)和常氧無(wú)糖(21%O2-G-)組，低氧(0.1%O2)常糖組和低氧(0.1%O2)無(wú)糖組。于三氣培養(yǎng)箱及低氧培養(yǎng)箱中相應(yīng)氧濃度及培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖。

1.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活及增殖取對(duì)數(shù)HAC細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。以1.5×104個(gè)/ml密度接種于96孔板，每孔200 μl。按分組處理24、48、72、96及120 h后取出細(xì)胞，棄上清液，加入工作濃度為0.5 mg/ml的MTT(購(gòu)自Sigma)溶液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h；棄MTT溶液，每孔加入150 μl DMSO，微量振蕩器振蕩10 min將結(jié)晶完全溶解，利用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值(A值)，縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)AnnexinV/PI凋亡試劑盒(購(gòu)自Enzo Life Sciences)操作說(shuō)明，按實(shí)驗(yàn)分組以8×104個(gè)/皿的密度種植細(xì)胞于6 cm2的培養(yǎng)皿，相應(yīng)時(shí)間段處理及收集細(xì)胞；每個(gè)樣本取總數(shù)約為(0.5～1)×106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷，4℃無(wú)菌的1×PBS充分洗滌細(xì)胞2次；用400 μl結(jié)合緩沖液(1×)重懸細(xì)胞；加入5 μl FITC標(biāo)記的Annexin V，輕輕混勻后間隔5 min，再加入10 μl濃度為20 μg/ml的碘化丙啶(PI)溶液；混勻后室溫避光孵育10 min；立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)，WinMDI 2.8系統(tǒng)繪制流式圖并分析出凋亡率。

1.4HIF-1α表達(dá)的檢測(cè)采用Western印跡法用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，分別提取各組相應(yīng)時(shí)間段的細(xì)胞總蛋白，BCA法(碧云天)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，各組樣本取總蛋白20 g上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)(Phamacia)膜。封閉1 h后HIF-1α一抗(BD，1∶800)孵育過(guò)夜，以β-actin做內(nèi)參(1∶10 000)。于HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)行圖像掃描后成像分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)常氧和低氧條件下HAC細(xì)胞增殖情況0.1%的低氧下，HAC細(xì)胞仍可緩慢增殖，但增殖率較常氧組細(xì)胞增殖減慢(P<0.05)。無(wú)糖常氧組及無(wú)糖低氧組細(xì)胞增殖均明顯受到抑制(P<0.05)，無(wú)糖低氧組細(xì)胞增殖抑制更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2HAC細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的凋亡率與常氧常糖組比較，低氧常糖組細(xì)胞各時(shí)間段未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡(P>0.05)；無(wú)糖常氧及無(wú)糖低氧組48 h細(xì)胞凋亡顯著(P<0.05)，48 h低氧無(wú)糖組細(xì)胞凋亡明顯低于常氧無(wú)糖組(P<0.05)，72 h凋亡則顯著高于常氧無(wú)糖組(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

圖1　HAC細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線

常氧常糖組常氧無(wú)糖組低氧常糖組低氧無(wú)糖組24p.97±0.344.86±0.573.26±0.143.52±0.4548p.06±0.4610.54±0.481)4.32±0.738.16±0.151)2)72p.13±0.715.11±0.181)5.08±0.2117.37±0.591)2)

與常氧常糖組比較：1)P<0.05；與常氧無(wú)糖組比較：2)P<0.05

圖2　各組HAC細(xì)胞凋亡率

2.3各組HIF-1α蛋白表達(dá)常氧下HAC細(xì)胞少量表達(dá)HIF-1α，低氧組HIF-1α表達(dá)量較常氧組明顯增高；各個(gè)時(shí)段均以低氧常糖組表達(dá)量最高，其次為低氧無(wú)糖組，常氧無(wú)糖組及常氧常糖組表達(dá)量均較低。低氧無(wú)糖組在處理24 h后表達(dá)量開(kāi)始增高，48 h達(dá)最高，72 h則逐漸降低。低氧常糖組24 h開(kāi)始增高，并持續(xù)至72 h(圖3)。

圖3　各組HIF-1α蛋白表達(dá)差異

3討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞在低氧下的反應(yīng)與腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)有著十分密切的關(guān)系，本文結(jié)果說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞具有很強(qiáng)的耐低氧能力，當(dāng)葡萄糖存在的條件下，即便是極度低氧下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生適應(yīng)性改變，調(diào)整其生物學(xué)行為，減緩增殖速率，降低能量消耗，從而避免過(guò)度消耗內(nèi)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的生存狀態(tài)，從而防止了細(xì)胞發(fā)生大量死亡。學(xué)者〔15〕研究了0.1%的低氧條件下培養(yǎng)8 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞可保持正常的細(xì)胞形態(tài)，僅表現(xiàn)為輕度的代謝障礙現(xiàn)象的表現(xiàn)：主要是細(xì)胞折光性變?nèi)酰喞訌?qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡、脂滴或顆粒樣物質(zhì)等，證明這些細(xì)胞對(duì)線粒體功能受限具有較強(qiáng)的耐受性。Schmid-Brunclik等〔15〕的研究也證實(shí)了在極度低氧下6 h星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯凋亡，但卻顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究延長(zhǎng)了極度低氧的時(shí)限，發(fā)現(xiàn)極度低氧后，與之前的研究〔15，16〕一致的是星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡并未受到影響，相反還可發(fā)生增殖，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖速度減慢。

低氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝方式由正常時(shí)有氧代謝為主轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解的能力加強(qiáng)，以便保證維持細(xì)胞在低氧下的能量代謝的需要。與此相適應(yīng)的是星形膠質(zhì)細(xì)胞在低氧下具有很高的內(nèi)源性乳酸脫氫酶(LDH)活性，以提高無(wú)氧糖酵解的效率，以滿足細(xì)胞在低氧下的能量代謝需要，最終拮抗細(xì)胞凋亡〔16〕。但腦組織在缺血缺氧的過(guò)程中卻常常伴隨無(wú)糖逆境的出現(xiàn)，有研究表明，低氧條件下葡萄糖含量的不同，引起組織損傷的程度也不同〔17〕。目前氧和葡萄糖剝奪模型已成為缺血缺氧的常用模型，基于這個(gè)模型進(jìn)行大量對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的能量代謝方式及神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制方面的研究，較為一致的結(jié)論是：氧和葡萄糖剝奪可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死，而一些物質(zhì)可以減輕由此引起的細(xì)胞損傷〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)在常氧下葡萄糖剝奪可通過(guò)細(xì)胞毒性作用，即增加氧化物和氮化物及脂質(zhì)體的影響星形神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸代謝并損害星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能〔19〕。Danilov等〔20〕研究了正常氧濃度葡萄糖剝奪和低氧(7%O2)葡萄糖剝奪4 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低的氧濃度下葡萄糖剝奪所誘發(fā)的細(xì)胞死亡反而更少，這提示了低氧可能保護(hù)了無(wú)糖逆境下所誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞使其免于氧化應(yīng)激損傷。本文提示葡萄糖缺乏可作為獨(dú)立因素誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，但極度低氧可在短期內(nèi)部分逆轉(zhuǎn)無(wú)糖逆境所引起的細(xì)胞凋亡和增殖，即低氧對(duì)無(wú)糖逆境中的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用的存在可能得益于低氧下的糖酵解代謝方式的快速啟動(dòng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞利用細(xì)胞內(nèi)殘存的少量葡萄糖及乳酸等糖酵解的產(chǎn)物進(jìn)行能量代謝。而越是耐受低氧的細(xì)胞其快速啟動(dòng)糖酵解的能力更強(qiáng)。由于常氧下培養(yǎng)的細(xì)胞主要的代謝方式為葡萄糖的氧化磷酸化，將蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化呈氧化磷酸化產(chǎn)物的過(guò)程則需要一定的時(shí)間，因而出現(xiàn)了嚴(yán)重的能量代謝障礙，從而引起大量的細(xì)胞死亡。但在葡萄糖剝奪后72 h，結(jié)果卻發(fā)生不同的改變，說(shuō)明極度低氧對(duì)無(wú)糖逆境的保護(hù)作用在時(shí)間上是有限的，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖等無(wú)氧酵解的產(chǎn)物耗竭，這種保護(hù)作用會(huì)逐漸消失。

HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α亞基的活性和表達(dá)，因其結(jié)構(gòu)中還存在有氧依賴(lài)的降解結(jié)構(gòu)域(ODD)，因此HIF-1α極易在常氧下降解。在低氧下，HIF-1α趨于穩(wěn)定，因而在某些低氧細(xì)胞和組織中大量表達(dá)。學(xué)者〔21〕就對(duì)慢性腦缺氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在輕度低氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)快速增高，并且持續(xù)14 d，至21 d后HIF-1α才開(kāi)始回落。在嚴(yán)重低氧下(0.1% O2)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與正常氧濃度下細(xì)胞比較未發(fā)生明顯改變，并且同時(shí)伴隨HIF-1α表達(dá)的增高，當(dāng)用HIF-1α抑制劑阻斷其作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變并出現(xiàn)死亡，說(shuō)明了HIF-1α表達(dá)可能保護(hù)了低氧下的星形膠質(zhì)細(xì)胞。低氧下GSH可增加HIF-1α的穩(wěn)定性，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，阻斷GSH的表達(dá)則降低HIF-1α的水平，從而減輕低氧誘導(dǎo)的谷氨酸毒性作用對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響〔22〕。這些研究結(jié)果均提示星形膠質(zhì)細(xì)胞低氧保護(hù)作用主要通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)。去鐵胺(DFX)預(yù)處理可明顯減少氧和葡萄糖剝奪所引起的細(xì)胞凋亡和腫脹，并且減少LDH及ROS的釋放，降低caspase-3的水平而上調(diào)HIF-1α的水平〔23〕，說(shuō)明HIF-1α上調(diào)可能保護(hù)氧和葡萄糖剝奪引起的細(xì)胞損傷。本文發(fā)現(xiàn)低氧可對(duì)抗無(wú)糖逆境所誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，極度低氧下無(wú)論葡萄糖存在與否均可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)水平增高。而在常氧條件下，無(wú)論葡萄糖存在與否，星形膠質(zhì)內(nèi)HIF-1α均呈低表達(dá)?？梢酝茰y(cè)低氧通過(guò)HIF-1α的作用可部分逆轉(zhuǎn)葡萄糖剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但其作用僅限于一定的時(shí)限內(nèi)。綜上，腦星形膠質(zhì)細(xì)胞可耐受極度低氧；葡萄糖缺乏可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡并抑制其增殖；低氧可對(duì)抗葡萄糖缺乏對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

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〔2014-12-07修回〕

(編輯苑云杰)