張　珂，張　霞，孫彩萍，胡　濱

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014)

多藥耐藥相關(guān)蛋白2基因在COC1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥中的作用

張珂，張霞，孫彩萍，胡濱

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014)

[摘要]目的觀察順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系COC1/DDP中多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)基因的表達(dá)，探討其反義寡脫氧核苷酸(ASODN)對(duì)COC1/DDP順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。方法設(shè)計(jì)合成針對(duì)MRP2的ASODN，以200 nmol·L-1濃度轉(zhuǎn)染COC1/DDP細(xì)胞，用四甲基偶氮唑藍(lán)法觀察順鉑對(duì)細(xì)胞抑制率的影響，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)MRP2基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果COC1/DDP細(xì)胞中MRP2基因呈高表達(dá)，其mRNA相對(duì)表達(dá)值為0.420 0±0.050 0，而COC1細(xì)胞中無表達(dá)。與COC1/DDP組比較，MRP2-ASODN組MRP2基因低表達(dá)，mRNA相對(duì)表達(dá)值為0.018 7±0.023 0，耐藥指數(shù)降低為4.58，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SODN組MRP2表達(dá)及耐藥指數(shù)改變差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論MRP2基因高表達(dá)與COC1細(xì)胞獲得順鉑耐藥性有密切關(guān)系；MRP2-ASODN能有效逆轉(zhuǎn)COC1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；順鉑；反義寡核苷酸；多藥耐藥性

如何逆轉(zhuǎn)特別是在基因水平逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑耐藥是臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)技術(shù)是指用一段人工合成的能與mRNA互補(bǔ)結(jié)合的DNA單鏈來抑制基因的表達(dá)。我們觀察了人多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multi-drug resistance related protein-2，MRP2)基因在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP與其親代細(xì)胞間表達(dá)的差異。并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的ASODN抑制其表達(dá)，觀察細(xì)胞耐藥性的改變，為臨床逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人卵巢癌細(xì)胞系COC1及順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系COC1/DDP購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；順鉑購自山東齊魯制藥廠；脂質(zhì)體Oligofectamin購自美國Invitrogen 公司；抗人MRP2小鼠單克隆抗體購自深圳晶美公司；四甲基氮唑藍(lán)購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購自深圳晶美公司；PCR反應(yīng)試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞中MRP2基因的表達(dá)使用逆轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定(轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞均行測(cè)定，所有研究至少重復(fù)3次)細(xì)胞中MRP2基因的表達(dá)。MRP2引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。MRP2(453 bp)上游引物序列 5’-GGAACAATTGTAGAGAAAGGATC-3’，下游引物序列 5’-CACAAACGCAACGATGATGAAGAA-3’；內(nèi)參照β-actin(317 bp)上游引物序列 5’-GTGGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；下游引物序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對(duì)MRP2的ASODN及錯(cuò)義寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide，SODN)由北京賽百勝公司合成。其序列如下：MRP2-ASODN：3’-TCAGGTCCTTAGTACGA-5’；SODN: 5’-AGTAGGCTTGCCTGGCAG-3’。測(cè)定的細(xì)胞分為3組(MRP2-ASODN組、COC1/DDP組、SODN組)。參考脂質(zhì)體Oligofectamin說明書制備脂質(zhì)體寡核苷酸復(fù)合物后轉(zhuǎn)染COC1/DDP細(xì)胞，MRP2-ASODN及SODN濃度為200 nmol·L-1。每組復(fù)設(shè)4孔。

1.4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及耐藥指數(shù)測(cè)定接種3組細(xì)胞于96孔板，加入不同濃度的順鉑(0.5、1、2、2.5、5、10、20、40 μg·mL-1)20 mL，各濃度設(shè)3個(gè)平行孔，空白孔加入PBS。孵育48 h后每孔加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，孵育4 h，離心振蕩后測(cè)定吸光度A值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值×100%。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組平均吸光度A值-加藥組平均吸光度A值)/對(duì)照組平均吸光度A值×100%。半效抑制量(IC50)應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行Probit回歸后求得。耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞株IC50/敏感細(xì)胞株IC50。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞中MRP2基因的表達(dá)COC1細(xì)胞中MRP2基因呈陰性表達(dá)，COC1/DDP細(xì)胞中MRP2 mRNA相對(duì)表達(dá)值為0.420 0±0.050 0。COC1細(xì)胞IC50值為(0.79±0.06)μg·mL-1，COC1/DDP細(xì)胞為(5.62±0.13)μg·mL-1，RI為7.20。見圖1。

圖1　不同細(xì)胞中MRP2基因的表達(dá)

1:COC1中β-actin；2:COC1/DDP中β-actin；3:COC1中MRP2；4:COC1/DDP中MRP2

2.2轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中MRP2的mRNA表達(dá)的改變MRP2-ASODN組、SODN組MRP2 mRNA相對(duì)表達(dá)值分別為0.018 7±0.023 0(與COC1/DDP組的0.370 0±0.008 6比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)、0.398 5±0.033 1(與COC1/DDP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05)。MRP2-ASODN組與SODN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MRP2-ASODN能顯著降低COC1/DDP細(xì)胞中MRP2的表達(dá)。見圖2。

圖2　轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中MRP2的mRNA表達(dá)的改變

1:MRP2-ASODN組β-actin；2:SODN組β-actin；3:COC1/DDP組β-actin；4:MRP2-ASODN組MRP2；5:SODN組MRP2；6:COC1/DDP組MRP2

2.3轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞耐藥性的改變與COC1/DDP組比較，MRP2-ASODN組的細(xì)胞IC50值下降了35.6%，為(3.62±0.29)μg·mL-1，RI為4.58(P<0.05)；SODN組的細(xì)胞IC50值略有降低，為(5.64±0.21)μg·mL-1，RI為7.14(P>0.05)。與SODN組比較，MRP2-ASODN組的細(xì)胞IC50值及RI均有明顯降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞抑制率的改變轉(zhuǎn)染相應(yīng)基因的ASODN能顯著增加順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制率。見圖3。

圖3　轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞抑制率的改變

3討論

MRP2屬于ABC蛋白超家族[1]，是廣泛存在于細(xì)胞膜上的能量依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)多種藥物以及陰離子化合物等物質(zhì)。在腫瘤對(duì)順鉑耐藥的產(chǎn)生過程中，細(xì)胞內(nèi)藥物聚集濃度的降低起著重要的作用[2]。研究[3]證明MRP2在體內(nèi)具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種抗腫瘤藥物的功能。國內(nèi)外對(duì)于MRP2是否導(dǎo)致腫瘤順鉑耐藥進(jìn)行了大量的研究，但至今尚無定論。Materna 等[4]對(duì)卵巢癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤以及黑色素瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)3種對(duì)順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中MRP2均呈高表達(dá)狀態(tài)，其后針對(duì)MRP2基因設(shè)計(jì)了特異性核酶以封閉基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后明顯降低了3種細(xì)胞的順鉑的耐藥性。曾曉勇等[5]對(duì)于膀胱癌的研究認(rèn)為MRP2的表達(dá)與膀胱癌對(duì)順鉑的耐藥性并不相關(guān)。

ASODN屬于反義寡核苷酸技術(shù)的一種，利用體外合成的單鏈DNA分子通過與mRNA的特異性結(jié)合從而抑制目的基因的表達(dá)。St?ckel等[6]對(duì)MRP2基因的研究表明核苷酸序列-517和-197對(duì)MRP2的基礎(chǔ)表達(dá)是決定性的。本研究將MRP2-ASODN序列設(shè)計(jì)在該區(qū)間的成環(huán)區(qū)，BLAST同源分析與人MRP2基因高度同源，符合寡核苷酸的設(shè)計(jì)原則。

我們應(yīng)用MRP2-ASODN轉(zhuǎn)染COC1/DDP細(xì)胞，顯著降低了該基因mRNA的表達(dá)，因此本研究所設(shè)計(jì)的ASODN可以特異性作用于靶基因，在轉(zhuǎn)錄水平抑制其表達(dá)。同時(shí)，本研究采用陽離子脂質(zhì)體包裹ASODN提高了轉(zhuǎn)染效率。

本研究結(jié)果證實(shí)了MRP2在COC1/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥產(chǎn)生中的作用，為應(yīng)用反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供了可能，并為尋找卵巢癌臨床有效的化療方案提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

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[5]曾曉勇,楊為民,葉章群,等.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多藥耐藥相關(guān)蛋白基因在膀胱癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2002,31(6):649-652.

[6]St?ckel B, K?nig J, Nies AT, et al.Characterization of the 5’-flanking region of the human multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene and its regulation in comparison withthe multidrug resistance protein 3 (MRP3) gene[J].Eur J Biochem, 2000, 267(5):1347-1358.

作者簡(jiǎn)介：張珂(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：kkxxzj@126.com 吳曉翠(1964-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放療相關(guān)研究。E-mail：wangmamamm@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.001

[中圖分類號(hào)]R737.31；R730.53

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2015)05-0369-03

(收稿日期：2015-06-12)

基金項(xiàng)目：國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目

通信作者：孟輝(1973-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制研究。E-mail：menghuidrch@163.com

Effect of Multi-drug Related Protein-2 in the
Cisplatin Resistance of COC1/DDP Cells

Zhang Ke, Zhang Xia, Sun Caiping, Hu Bin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecond

AffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of multi-drug resistance related protein-2 (MRP2) of COC1/DDP cell line, and the reversion of cisplatin resistance by antisense oligodeoxynucleotide (ASODN).MethodsThe ASODN targeting MRP2 was designed and synthesized.The ASODN targeting MRP2 with the concentration of 200 nmol·L-1was transferred into COC1/DDP cells by lipofectin.The inhibition rate of transferred cells to cisplatin was detected with MTT assay.The altered expression of MRP2 was detected by reverse transcription PCR.ResultsMRP2 were overexpressed in cisplatin resistant cell line of COC1/DDP compared with COC1 cell line.Compared with the COC1/DDP cell group, MRP2 expression in the MRP2-ASODN transfected cell group was significantly decreased to 0.018 7±0.023 0, and the resistance index was 4.58 (P<0.05); there were no difference in the MRP2 expression and resistance index between the COC1/DDP cell group and the SODN group (P>0.05).ConclusionThe overexpression of MRP2 may play an important role in the induction of resistance of COC1/DDP cells to cisplatin; MRP2-ASODN can effectively reverse the resistance of COC1/DDP cells to cisplatin and increase their drug sensitivity in a sequence specific manner.

[Key words]ovarian neoplasms; cisplatin; antisense oligodeoxynucleotide; multi-drug resistance