劉友華

新型瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)食品中天然防腐劑ε-聚賴氨酸含量

劉友華

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

為分析食品中ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）含量，建立一種新型瓊脂擴(kuò)散法，并對(duì)分析條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證在檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)的有效性。結(jié)果表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%亞甲基藍(lán)、0.75%瓊脂、ε-PL溶液pH值為2.0、牛津杯加液量750 μL時(shí)檢測(cè)結(jié)果最佳。本方法允許檢測(cè)橙汁中ε-PL最低含量為2 mg/kg、糕點(diǎn)和豬肉火腿中最低為10 mg/kg。這種新型瓊脂擴(kuò)散法具有操作簡(jiǎn)便、使用成本低、專一性高等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于ε-PL生產(chǎn)企業(yè)和食品工業(yè)。

ε-聚賴氨酸；檢測(cè)；瓊脂擴(kuò)散法；亞甲基藍(lán)；牛津杯；食品

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種由鏈霉菌屬的微生物以非核糖體合成方式積累的聚氨基酸，它由人體必需氨基酸賴氨酸通過α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵連接而成[1-3]。由于ε-PL是聚陽離子物質(zhì)，它能夠通過靜電作用吸附到微生物表面，破壞其細(xì)胞膜并進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)繁殖，因此它能夠抑制包括革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌在內(nèi)的多種微生物的生長(zhǎng)繁殖[4-7]。此外，ε-PL具有很好的水溶性、熱穩(wěn)定性，并且無異味[8-9]?；谏鲜錾锘钚砸约岸纠韺?shí)驗(yàn)證明的安全性[10-11]，ε-PL已經(jīng)被允許作為食品防腐劑在日本、韓國、美國等多個(gè)國家添加使用，它在常見食品中的添加量為50～500 mg/kg[2]?，F(xiàn)在國內(nèi)有多家科研單位進(jìn)行ε-PL開發(fā)，其中幾家單位的ε-PL項(xiàng)目已成功完成中試。國家衛(wèi)生計(jì)生委于2014年4月批準(zhǔn)ε-PL為食品添加劑新品種，添加量在150～250 mg/kg范圍之內(nèi)。然而到目前為止，還鮮見國內(nèi)外檢測(cè)食品中ε-PL含量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我國也尚未制定食品中ε-PL的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。為便于國家食品安全部門監(jiān)管ε-PL在食品中的使用和相關(guān)企業(yè)推廣ε-PL作為防腐劑在食品工業(yè)中應(yīng)用，急需建立食品中ε-PL的檢測(cè)方法。

目前ε-PL的檢測(cè)方法均為檢測(cè)發(fā)酵液中的ε-PL而建立的，主要有比色法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-14]。但比色法并不適合檢測(cè)食品中ε-PL含量，因?yàn)槭称窛岫韧ǔ：芨?，?huì)影響比色測(cè)定。采用HPLC法來檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)，由于食品組分復(fù)雜，發(fā)現(xiàn)HPLC法不易將ε-PL和食品組分分開，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度，目前還在研究之中。瓊脂擴(kuò)散法是一種常用的定量方法，它的原理為：待測(cè)物質(zhì)在平板上擴(kuò)散時(shí)，能形成明顯的擴(kuò)散圈，擴(kuò)散圈直徑與待測(cè)物質(zhì)含量對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系[15-17]。近來，在探索ε-PL生產(chǎn)菌株篩選方法的過程中，Nishikawa等[18]發(fā)現(xiàn)，由于ε-PL和堿性染料亞甲基藍(lán)之間的靜電作用，當(dāng)ε-PL在含有亞甲基藍(lán)的瓊脂平板上擴(kuò)散時(shí)，能形成清晰的擴(kuò)散圈，并且ε-PL質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與上述擴(kuò)散圈直徑之間有很好的線性關(guān)系?；谏鲜鲈肀緦?shí)驗(yàn)建立一種新型瓊脂擴(kuò)散法，并且對(duì)此方法檢測(cè)食品中ε-PL含量的適用性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ε-PL標(biāo)品Ⅰ（約40 個(gè)賴氨酸殘基，由Kitasatospora sp. NY 2-11發(fā)酵合成，純度98%）、ε-PL標(biāo)品Ⅱ（約30個(gè)賴氨酸殘基，純度99%） 日本Chisso公司；Nisin浙江銀象生物工程有限公司；亞甲基藍(lán) 美國Sigma公司；橙汁 匯源集團(tuán)有限公司；糕點(diǎn) 市購；豬肉火腿 雨潤(rùn)控股集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

牛津杯（內(nèi)徑（6.0±0.1） mm、外徑（7.8±0.1） mm、高（10±0.1） mm） 上海江星儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL儲(chǔ)備溶液的制備

精確稱取1 g ε-PL，溶解到100 mL溶劑中，5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 4.0或pH 2.0，作為儲(chǔ)備液。使用時(shí)，此儲(chǔ)備液用pH 4.0或pH 2.0溶劑進(jìn)一步稀釋到所需ε-PL質(zhì)量濃度。儲(chǔ)備液在4 ℃條件下可保存1 周。

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散法

滅菌后，待含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%亞甲基藍(lán)的瓊脂溶液冷卻到45 ℃，取10 mL瓊脂溶液以無菌操作的方式加到培養(yǎng)皿中（100 mm×15 mm），凝固后作為瓊脂平板。在瓊脂平板上等距離安放牛津杯。將240 μL樣品溶液加入各個(gè)牛津杯內(nèi)，然后將平板轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱，在30 ℃條件下進(jìn)行擴(kuò)散，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。待牛津杯內(nèi)的溶液擴(kuò)散完畢，取下牛津杯，水平和垂直測(cè)量擴(kuò)散圈直徑，并記錄平均值。

以ε-PL質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為自變量，相應(yīng)的擴(kuò)散圈直徑為因變量，按下式計(jì)算回歸直線方程：

Y=a×lgX＋b

式中：X為ε-PL溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；Y為擴(kuò)散圈直徑/mm；a為回歸直線斜率；b為回歸直線截距。

本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度（被測(cè)量的測(cè)得值與其真值間的一致程度）以回歸直線的斜率判斷。斜率越大擴(kuò)散性越好，反之越差。精密度（在規(guī)定條件下，對(duì)同一或類似被測(cè)對(duì)象重復(fù)測(cè)量所得示值或測(cè)得值間的一致程度）用來驗(yàn)證在給定ε-PL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)回歸方程的有效性，以回歸方程的回歸系數(shù)來判斷。標(biāo)準(zhǔn)曲線與Y軸截距可反映測(cè)定的靈敏度。

1.3.3 待測(cè)食品的處理

將待測(cè)食物浸泡20 min，均質(zhì)后調(diào)節(jié)pH值為2.0，70 ℃加熱10 min，10 000 r/min離心10 min，然后收集上清液作為食物浸液進(jìn)行ε-PL含量檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以ε-PL質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為自變量，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)散圈直徑為因變量，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。通過單因素方差分析各參數(shù)（斜率、靈敏度、R2、回收率）的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過Turkey法進(jìn)行對(duì)比分析，顯著性水平為P=0.05。所有的數(shù)據(jù)分析均采用Origin Profession 8.0軟件包進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 評(píng)估瓊脂擴(kuò)散法分析ε-PL含量

為研究食品中其他物質(zhì)對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響，按表1制備各種物質(zhì)溶液，以1.3.2節(jié)平板擴(kuò)散法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示；為研究擴(kuò)散圈與ε-PL含量之間的線性關(guān)系，以蒸餾水為溶劑，配制一系列pH 4.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（50、100、200、400、600、1 000 mg/L），對(duì)照為pH 4.0的蒸餾水，也在同樣條件下進(jìn)行擴(kuò)散。結(jié)果如圖1所示。

表 1 常見的防腐劑、金屬鹽、糖類物質(zhì)、蛋白類物質(zhì)在亞甲基藍(lán)瓊脂平板上的擴(kuò)散Table 1 Diffusion of common preservatives, metal salts, saccharides,and proteins on agar plate containing methylene blue mm

ε-PL是一種聚陽離子物質(zhì)，而亞甲基藍(lán)是一種陽離子染料，當(dāng)ε-PL在含有亞甲基藍(lán)的瓊脂平板上擴(kuò)散時(shí)，由于ε-PL和堿性染料之間的靜電排斥作用，可觀測(cè)到擴(kuò)散圈。結(jié)果如表1所示，L-賴氨酸（ε-PL的單體）、常用食品防腐劑以及其他物質(zhì)均不會(huì)形成擴(kuò)散圈。而ε-PL標(biāo)品Ⅰ和ε-PL標(biāo)品Ⅱ均形成清晰的擴(kuò)散圈，并且兩者之間的擴(kuò)散圈直徑差異不顯著（P＞0.05），說明ε-PL分子質(zhì)量對(duì)擴(kuò)散圈直徑影響不明顯。如無特殊說明，以下實(shí)驗(yàn)均采用ε-PL標(biāo)品Ⅰ作為ε-PL樣品。

如圖1a所示，隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，擴(kuò)散圈直徑逐漸增大，而對(duì)照沒有擴(kuò)散圈形成。在采用微生物瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)Nisin過程中，Nisin在接種指示菌的平板上擴(kuò)散時(shí)，會(huì)形成清晰的抑菌圈，并且Nisin質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值和抑菌圈直徑之間有線性關(guān)系[16-17]。因此，對(duì)上述擴(kuò)散圈直徑和ε-PL質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)直線的回歸系數(shù)達(dá)到0.996 8，說明兩者之間有很好的線性關(guān)系（圖1b）。

圖 1 1 ε-PL在亞甲基藍(lán)瓊脂平板上的擴(kuò)散作用Fig.1 Diffusion of ε-PL on agar plate containing methylene blue

2.2 瓊脂擴(kuò)散法分析條件的優(yōu)化

分析食品中ε-PL需要較高的靈敏度，而初始的分析條件不能滿足上述要求。參考微生物瓊脂擴(kuò)散法定量Nisin中的主要影響因素[15,17]，選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的亞甲基藍(lán)、瓊脂、瓊脂厚度、ε-PL溶液的pH值、牛津杯加液量為影響因素，優(yōu)化瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)食品中ε-PL的分析條件。

2.2.1 亞甲基藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)亞甲基藍(lán)（0.001%、0.001 5%、0.002%、0.003%、0.004%）的平板上進(jìn)行擴(kuò)散。結(jié)果如表2所示。

表 2 亞甲基藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響Table 2 Effect of methylene blue concentration on agar diffusion assay

擴(kuò)散前，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%以上亞甲基藍(lán)的平板顏色均為藍(lán)色。擴(kuò)散后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001 5%亞甲基藍(lán)平板上形成不清晰的擴(kuò)散圈（邊緣模糊）。推測(cè)可能0.001%和0.001 5%亞甲基藍(lán)平板含有的正電荷染料太少，不能完全抵抗ε-PL的靜電排斥作用，一些亞甲基藍(lán)分子移動(dòng)較快，而一些亞甲基藍(lán)分子移動(dòng)較慢，因此導(dǎo)致擴(kuò)散圈邊緣不清晰。

不同亞甲基藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的斜率之間并沒有顯著差異（P＞0.05），因此不同亞甲基藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不會(huì)影響該方法的準(zhǔn)確度。另一方面，發(fā)現(xiàn)隨著亞甲基藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，靈敏度明顯的下降。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)亞甲基藍(lán)之間擴(kuò)散時(shí)間的差異不大，均為16 h。因此，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%亞甲基藍(lán)為瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)酵液和食品中ε-PL含量時(shí)的分析條件。

2.2.2 瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、2.00%）平板上進(jìn)行擴(kuò)散。結(jié)果如表3所示。

當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于0.75%時(shí)，平板上均形成了清晰的擴(kuò)散圈；而對(duì)于瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的平板，此條件下由于部分瓊脂發(fā)生液化，導(dǎo)致擴(kuò)散圈不清晰。隨著瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，回歸直線斜率（彼此差異顯著，P＜0.05）逐漸下降（表3），因此降低瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)增加瓊脂擴(kuò)散法的準(zhǔn)確性。而隨著瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少，靈敏度逐漸增加；和2.00%瓊脂相比，0.75%瓊脂靈敏度增加了236.5%。除了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%瓊脂的擴(kuò)散時(shí)間為18 h，其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂的擴(kuò)散時(shí)間均為16 h。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%瓊脂具有高的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此選擇作為檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)的分析條件。

2.2.3 瓊脂厚度對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響

將一系列pH 4.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在分別裝有不同體積瓊脂溶液（10、15、20、25、30 mL）的平板上進(jìn)行擴(kuò)散。結(jié)果如表4所示。

表 4 瓊脂厚度對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響Table 4 Effect of agar depth on agar diffusion assay

如表4所示，不同瓊脂厚度對(duì)應(yīng)回歸直線斜率之間差異不顯著（P＞0.05），因此瓊脂厚度不會(huì)影響該方法的準(zhǔn)確度。然而，隨著瓊脂厚度的減小，靈敏度顯著增加。和20 mL瓊脂溶液相比，10 mL瓊脂溶液的靈敏度增加了206%。15～30 mL瓊脂溶液的擴(kuò)散時(shí)間均為16 h，而10 mL瓊脂溶液的擴(kuò)散時(shí)間略微延長(zhǎng)，為18 h。10 mL瓊脂溶液是能夠形成瓊脂平板的最小瓊脂溶液體積，它具有高的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此選擇作為檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)的分析條件。

2.2.4 ε-PL溶液pH值對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響

配制pH值分別為2.0、3.0、4.0、6.0、8.0的5 種ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（100、200、300、400、600、800、1 000 mg/L）在平板上進(jìn)行擴(kuò)散。

ε-PL的等電點(diǎn)為9.0[19]，當(dāng)ε-PL溶液pH低于9.0時(shí)，它會(huì)攜帶大量的正電荷，并且隨著pH值降低，其所帶正電荷的數(shù)量逐漸增加。因此ε-PL溶液的pH值會(huì)顯著影響其在瓊脂平板上形成的擴(kuò)散圈大小。如表5所示，pH 4.0和pH 6.0的斜率之間沒有顯著差異；但是，和pH 4.0相比，pH 2.0、3.0、8.0的斜率顯著下降（P＜0.05）。另一方面，隨著pH值下降，靈敏度顯著增加，特別是pH值從3.0降到2.0，靈敏度增加了94.5%。并且擴(kuò)散時(shí)間均為16 h，回歸直線的R2值均較高，說明pH值對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的擴(kuò)散時(shí)間和精密度影響不明顯。ε-PL的pH值低于2.0時(shí)，易發(fā)生降解，綜合考慮選擇pH 2.0作為檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)的分析條件。

表 5 5 ε-PL溶液pH值對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響Table 5 Effect off ε-PL solution pH on agar diffusion assay

2.2.5 牛津杯加液量對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響

配制一系列pH 4.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（50、100、200、300、400、600、800 mg/L），然后將250、500、750、1 000、1 250 μL ε-PL溶液分別在瓊脂平板上擴(kuò)散。由于牛津杯的最大加液量為250 μL，當(dāng)加液量超過250 μL時(shí)，首先牛津杯中加入250 μL ε-PL溶液，擴(kuò)散完后，再次加入250 μL，直到擴(kuò)散完一定體積的ε-PL溶液。

表 6 牛津杯加液量對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響Table 6 Effect off ε-PL solution volume added to Oxford cup on agar diffusion assay

如表6所示，各牛津杯加液量的斜率均顯著不同（P＜0.05），隨著牛津杯加液量增加，斜率顯著上升，擴(kuò)散時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，同時(shí)靈敏度顯著增加（P＜0.05）。但隨著牛津杯加液量增加，R2有所下降。一個(gè)可接受的回歸直線，其R2應(yīng)該不小于0.98，因此盡管1 000 μL和1 250 μL牛津杯加液量有較高的靈敏度，但并不適合作為檢測(cè)條件。綜合靈敏度和精密度考慮，選擇750 μL作為檢測(cè)食品中ε-PL含量時(shí)的分析條件。

2.2.6 瓊脂擴(kuò)散條件的驗(yàn)證

為驗(yàn)證上述優(yōu)化的檢測(cè)食品中ε-PL條件的有效性，將750 μL一系列pH 2.0的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（2、3、5、10、15、20、25、35、50 mg/L）在瓊脂平板（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%亞甲基藍(lán)、0.75%瓊脂、瓊脂溶液量10 mL）上進(jìn)行擴(kuò)散。

圖 2 2 ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同分析條件下的回歸直線Fig.2 Regression lines for ε-PL standards diffused under initial assay conditions

圖2 顯示了在初始和優(yōu)化分析條件下，ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)應(yīng)的回歸直線。優(yōu)化的檢測(cè)食品中ε-PL條件的準(zhǔn)確度比初始條件增加了4.3%，檢出限從36.11 mg/L提升到1.64 mg/L。優(yōu)化的檢測(cè)食品中ε-PL條件的R2值為0.989 6，說明此條件下也具有較高的精密度。由以上數(shù)據(jù)推測(cè)，在上述優(yōu)化的分析條件下，瓊脂擴(kuò)散法可以高靈敏度檢測(cè)食品中ε-PL含量。

相比于Itazhaki比色法和HPLC法，目前瓊脂擴(kuò)散法具有簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。Itazhaki比色法檢測(cè)時(shí)間雖短，但是檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，并且由于食品大多有一定的濁度，此方法不適合測(cè)定食品中的ε-PL含量。HPLC法雖然重復(fù)性好，檢測(cè)迅速，由于ε-PL與蛋白質(zhì)的性質(zhì)相近，不易將其與蛋白類似物質(zhì)完全分開；此外HPLC法使用成本較高，不適合多數(shù)企業(yè)用戶的使用。

2.3 瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)食品中ε-PL含量

為研究瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)食品中ε-PL含量的有效性，選擇了3 種食品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。橙汁用來代表液體食物，糕點(diǎn)用來代表固體淀粉質(zhì)食物，豬肉火腿用來代表固體蛋白類食物。

2.3.1 食品組分對(duì)ε-PL在瓊脂平板上擴(kuò)散的影響

稱取5 g糕點(diǎn)或豬肉火腿加到20 mL蒸餾水中，經(jīng)處理，收集上清液。分別以蒸餾水、橙汁、5倍稀釋糕點(diǎn)浸液、5 倍稀釋豬肉火腿浸液為溶劑，制備一系列ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液（2、3、5、10、15、20、25 mg/L）。結(jié)果如圖3所示。

圖 3 不同溶劑制備的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的回歸直線Fig.3 Regression curves calculated from the diffusion of ε-PL standards on agar plates

以蒸餾水、橙汁、5 倍稀釋糕點(diǎn)浸液、5 倍稀釋豬肉火腿浸液為溶劑制備的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)回歸直線的R2值分別為0.988 2、0.991 3、0.990 6和0.985 6，這說明在2～25 mg/L ε-PL質(zhì)量濃度范圍，以食物浸液為溶劑時(shí)，擴(kuò)散圈直徑和ε-PL質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值之間也存在很好的線性關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)同樣質(zhì)量濃度的ε-PL溶液，當(dāng)以食物浸液為溶劑時(shí)，其擴(kuò)散圈直徑小于蒸餾水為溶劑時(shí)的擴(kuò)散圈直徑，推測(cè)可能食品中組分會(huì)阻擋ε-PL在瓊脂平板上擴(kuò)散。因此，為補(bǔ)償食品組分對(duì)瓊脂擴(kuò)散法的影響，應(yīng)該以一定稀釋倍數(shù)不含ε-PL的食物浸液為溶劑制備ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液，食品樣品稀釋相同的倍數(shù)，擴(kuò)散后，食物樣品的ε-PL含量從ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的回歸直線計(jì)算得出。這種條件下，可以最低檢測(cè)橙汁中2 mg/kg ε-PL、糕點(diǎn)和豬肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

2.3.2 食品中ε-PL含量的評(píng)估

取50 mg ε-PL加入1 L橙汁中，混勻后調(diào)pH 2.0；以pH 2.0蒸餾水為稀釋劑，將橙汁稀釋5、10、20 倍；然后橙汁和稀釋的橙汁溶液分別按上述步驟進(jìn)行預(yù)處理；樣品溶液在瓊脂平板上擴(kuò)散；最后樣品ε-PL含量從以蒸餾水為溶劑制備的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)應(yīng)回歸直線計(jì)算得出。對(duì)于糕點(diǎn)和豬肉火腿，100 mg ε-PL直接和1 kg糕點(diǎn)或豬肉火腿均質(zhì)，取5 g該食物，用pH 2.0蒸餾水分別稀釋5、10、20、30、40、50 倍。其他分析步驟和2.3.1節(jié)相同。

當(dāng)不能獲得未添加ε-PL的食物時(shí)，若從以蒸餾水為溶劑制備的ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)回歸直線計(jì)算食物中ε-PL含量，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏小。推測(cè)上層食品組分對(duì)ε-PL瓊脂擴(kuò)散的影響是由于食品成分高導(dǎo)致的，若適當(dāng)稀釋食物樣品，可能能夠減小食品組分對(duì)瓊脂擴(kuò)散分析的影響。對(duì)上述假設(shè)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表7所示。

表 7 瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)食品中ε--PPLL含量Table 7 Estimation off ε-PL in foods by agar diffusion assay mg/kg

由表7可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，食物中的ε-PL回收量逐漸上升，但當(dāng)橙汁的稀釋倍數(shù)高于5 倍、糕點(diǎn)的稀釋倍數(shù)高于20 倍和豬肉火腿的稀釋倍數(shù)高于30 倍時(shí)，ε-PL回收量變化不顯著（P＞0.05）。橙汁和蛋糕的ε-PL最大回收率高于95%，而豬肉火腿的最大回收率略低，為91.77%。豬肉火腿中較低的ε-PL回收量可能是由蛋白類物質(zhì)對(duì)ε-PL的強(qiáng)烈吸附作用造成的，在微生物瓊脂擴(kuò)散法定量高蛋白食品中Nisin（一種多肽類防腐劑）含量時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[20]。以上數(shù)據(jù)證明了上述假設(shè)的正確性，即食品中ε-PL含量也可以通過以下步驟檢測(cè)：根據(jù)待檢食物樣品的特點(diǎn)，將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，例如液體飲料稀釋5 倍，淀粉質(zhì)食品稀釋20 倍，而蛋白類食物稀釋到30 倍；預(yù)處理后，食物浸液在瓊脂平板上擴(kuò)散；最后從以蒸餾水為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的回歸直線計(jì)算食物樣品中ε-PL的含量。

3 結(jié) 論

瓊脂擴(kuò)散法分析食品中ε-PL的最佳分析條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%亞甲基藍(lán)、0.75%瓊脂、ε-PL溶液pH值為2.0、牛津杯加液量750 μL。食品成分會(huì)影響ε-PL在瓊脂平板上的擴(kuò)散，但這種干擾作用能夠通過稀釋樣品的方式消除。通過適當(dāng)?shù)闹苽洇?PL標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋樣品溶液，這種新型瓊脂擴(kuò)散法能夠可靠地定量檢測(cè)橙汁中最低2 mg/kg ε-PL、糕點(diǎn)和豬肉火腿中10 mg/kg ε-PL。

由于這種新型瓊脂擴(kuò)散法具有操作簡(jiǎn)便、使用成本低、專一性高等優(yōu)點(diǎn)，因此可以用于ε-PL生產(chǎn)企業(yè)、食品工業(yè)以及其他ε-PL相關(guān)科學(xué)研究中ε-PL的檢測(cè)。理論上，推測(cè)這種方法也可以用來檢測(cè)其他聚陽離子物質(zhì)，如聚精氨酸。此外，聚陰離子物質(zhì)，如γ-聚谷氨酸（另一種微生物合成的另一種聚氨基酸），可能也可以用類似原理進(jìn)行檢測(cè)。因此，這種新型瓊脂擴(kuò)散法也為定性、定量其他聚陽離子和聚陰離子物質(zhì)提供了一種新的研究思路。

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A Novel Agar Diffusion Assay for Qualitative and Quantitative Estimation of ε-Polylysine in Foods

LIU Youhua
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, Fuzhou 350002, China)

A novel agar diffusion assay was developed, optimized, and validated for the analysis of ε-polylysine (ε-PL) in foods. Re sults showed that the optimum assay conditions were 0.75% agar, 0.002% methylene blue, pH of ε-PL solution adjusted to 2.0 and 750 μL of ε-PL solution allowed to diffuse on agar plate. This method allowed detection of ε-PL at levels as low as 2 mg/kg in orange-juice, and 10 mg/kg in cake and pork ham. This proposed agar diffusion assay can be widely used in ε-PL-production and food industry because of its simplicity, cost-effectiveness, and high specificity.

ε-polylysine； determination； agar diffusion assay； methylene blue； Oxford cup； food

TS207.3

A

1002-6630（2015）08-0225-06

10.7506/spkx1002-6630-201508042

2014-08-26

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0015）

劉友華（1963—），男，高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)與發(fā)酵工程。E-mail：775729188@qq.com