潘 科，馮 林，陳 娟，杜 曉*

HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法分析不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶香氣成分

潘 科1,2，馮 林3，陳 娟2，杜 曉1,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 雅安 625014；2.貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別對不同通氧發(fā)酵工藝的紅茶樣品進(jìn)行香氣成分分析。結(jié)果表明：自然發(fā)酵紅茶樣品中鑒定出香氣化合物47 種；通氧45 min處理鑒定出53 種；通氧60 min處理鑒定出48 種；通氧75 min處理鑒定出79 種；通氧90 min處理鑒定出72 種；通氧105 min處理鑒定出77 種。6 個樣品檢測出的香氣成分主要以醇類為主，相對含量占60%以上，其次為酯類、醛類、碳?xì)漕惣巴?。通過分析比較，在同一茶樹品種條件下，紅茶通氧發(fā)酵加工工藝不會改變紅茶主要香氣成分的組成結(jié)構(gòu)；通氧發(fā)酵加工工藝有利于增加紅茶香氣化合物的種類。

紅茶；通氧發(fā)酵；頂空固相微萃?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用法；香氣

研究表明，加工過程是茶葉香氣物質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前，茶青中檢測出的揮發(fā)性成分近100 種，而茶葉中近700 種[1-3]。紅茶屬于全發(fā)酵茶，其香氣主要來自發(fā)酵過程內(nèi)含物質(zhì)的化學(xué)變化，以醇、醛、酮等化合物為主[4-5]。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，茶葉科技工作者針對茶樹品種、加工工藝、工藝參數(shù)等對紅茶特征香氣物質(zhì)及其化合物類型進(jìn)行了詳細(xì)的研究。竹尾忠一[6]、王華夫[7]、趙常銳[8]等研究，均表明香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇和苯乙醇是祁門紅茶的特征性香氣物質(zhì)。王秋霜等[9-10]研究表明，中國名優(yōu)紅茶香氣物質(zhì)主要包含醇類、酯類、醛類、酮類、烯類和烷烴類等。任洪濤等[11]研究表明，云南紅茶在加工過程中，芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇的相對含量大幅減少，而苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、苯乙醇的相對含量則大幅增加。周雪芳等[12]研究表明，四川工夫紅茶樣品香氣組分包括醇類、醛類、烯烴類、酯類、酸類、酮類、苯酚類化合物，其中醇類化合物含量較高，占66%左右。劉春麗等[13]研究表明，武夷山紅茶香氣成分以香葉醇、芳樟醇及其氧化物、2-苯乙醇、（E）-2-己烯醛為主。目前，紅茶發(fā)酵主要控制溫度、相對濕度、氧氣3 個因子，倪世俊[14]提出祁紅發(fā)酵室溫以24～28 ℃為宜。權(quán)啟愛[15]提出發(fā)酵溫度以24～25 ℃為最佳，郭雅玲[16]也持相同觀點。譚和平等[17]研究表明，22℃和28℃發(fā)酵條件下表現(xiàn)出的紅茶品質(zhì)最好。關(guān)于相對空氣濕度，從研究結(jié)果和生產(chǎn)實踐來看，普遍接受以90%以上的空氣濕度為宜，有的要求在95%以上[18-21]。針對氧氣對紅茶發(fā)酵影響的研究報告較少，實際生產(chǎn)過程采用定時翻拌發(fā)酵葉保證紅茶發(fā)酵所需的氧氣。

潘科等[22]研究表明，紅茶發(fā)酵過程中進(jìn)行通氧處理對發(fā)酵葉溫、pH值、發(fā)酵葉感官品質(zhì)變化影響明顯。化學(xué)反應(yīng)環(huán)境條件的改變，必然會對化學(xué)變化產(chǎn)生影響作用，紅茶香氣成分產(chǎn)生的實質(zhì)是化學(xué)變化的結(jié)果，本研究以黔湄601茶樹品種獨芽為原料，分別采用不同的通氧發(fā)酵工藝進(jìn)行處理，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（head space-solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用法分析樣品香氣成分，探索紅茶通氧發(fā)酵加工工藝對香氣形成的影響，為紅茶加工過程中提升香氣品質(zhì)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶青采自貴州省茶葉研究所湄潭基地茶園黔湄601茶樹品種，采摘標(biāo)準(zhǔn)為單芽。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010 GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；57330-U手動SPME進(jìn)樣器、非結(jié)合型聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；20 mL SPME專用樣品瓶 天津奧特塞斯公司；FA2004A分析天平 上海津天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品加工

加工工藝流程為：茶青→萎凋→揉捻→自然發(fā)酵/通氧發(fā)酵（通氧發(fā)酵時間）→干燥。按照加工工藝流程，共設(shè)置了6 個處理，分別為：a：茶青→萎凋→揉捻→自然發(fā)酵→干燥；b：茶青→萎凋→揉捻→通氧發(fā)酵45 min→自然發(fā)酵至適度→干燥→待測樣品；c：茶青→萎凋→揉捻→通氧發(fā)酵60 min→自然發(fā)酵至適度→干燥→待測樣品；d：茶青→萎凋→揉捻→通氧發(fā)酵75 min→自然發(fā)酵至適度→干燥→待測樣品；e：茶青→萎凋→揉捻→通氧發(fā)酵90 min→自然發(fā)酵至適度→干燥→待測樣品；f：茶青→萎凋→揉捻→通氧發(fā)酵105 min→自然發(fā)酵至適度→干燥→待測樣品。

通氧發(fā)酵設(shè)備：自制通氧發(fā)酵裝置，已獲實用新型專利授權(quán)，專利號：ZL201220113859.X。裝置結(jié)構(gòu)見圖1。自然發(fā)酵設(shè)備：竹簍、濕毛巾，每30 min翻拌茶堆1 次。

圖 1 通氧發(fā)酵裝置結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Schematic illustration of experimental set-up for oxygen ventilation during fermentation

6 個處理是在相同的萎凋和揉捻后等分為6 份，分別進(jìn)行不同發(fā)酵工藝處理后，加工成樣品待測。發(fā)酵適度的判定參照貴州紅茶加工技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[23]。

1.3.2 SPME條件

稱取磨碎茶樣1.0 g裝入20 mL SPME樣品瓶中，加蓋密封，分別加入5 mL沸超純水，加蓋密封，于70 ℃水浴鍋中平衡10 min，固相微萃取吸附50 min后，于GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)樣，解吸5 min[23-26]。

1.3.3 GC條件

DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；載氣He；升溫程序：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至85 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至110 ℃，以7 ℃/min升至130 ℃后即以5 ℃/min升至230 ℃保持8 min；柱箱溫度40 ℃[24-25]。

1.3.4 MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；MS接口溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～400 u[23-24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采集到的總離子色譜圖，采用計算機檢索，參考標(biāo)準(zhǔn)譜圖（NIST 05、NIST 05s），同時查閱文獻(xiàn)[9-13,24-25]，鑒定樣品中揮發(fā)性成分，并用峰面積歸一化法分析各成分相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶樣品香氣成分鑒定

6 種不同工藝紅茶樣品經(jīng)SPME萃取、GC-MS分析得到總離子流色譜圖見圖2。

圖 2 不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶樣品總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of black tea samples with oxygen ventilation for different periods of time during the fermentation process

表 1 不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶樣品成分鑒定表Table 1 Aroma components of black tea samples with oxygen ventilation for different periods of time during the fermentation process %

續(xù)表1 %

續(xù)表1 %

續(xù)表1 %

6 個樣品中分離鑒定出的香氣成分結(jié)果見表1。6 個處理樣品共分離鑒定出138 種香氣化合物，其中包括43 種醇類、26 種醛類、15 種酮類、2 種酸類、21 種酯類、26 種碳?xì)漕悺? 種含氮類和4 種雜氧化合物類。

a處理組共分離鑒定出47 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（24.03%）、水楊酸甲酯（20.02%）、反式香葉醇（19.51%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（6.51%）、苯乙醛（3.12%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（2.70%）、3,7-二甲基-1,5,7-十八烷三烯-3-醇（2.55%）、苯乙醇（2.00%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化-2H-吡喃-3-醇（1.64%）、反式橙花叔醇（1.43%）。

b處理組共分離鑒定出53 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（20.05%）、水楊酸甲酯（18.64%）、反式香葉醇（14.03%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（7.94%）、脫氫芳樟醇（5.44%）、苯乙醛（4.52%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（3.74%）、苯乙醇（2.41%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化-2H-吡喃-3-醇（2.05%）、β-月桂烯（1.68%）。

c處理組共分離鑒定出48 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（16.71%）、水楊酸甲酯（13.62%）、反式香葉醇（10.98%）、脫氫芳樟醇（9.43%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（7.73%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（5.43%）、苯乙醛（3.56%）、α-萜品醇（2.95%）、苯乙醇（2.55%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化-2H-吡喃-3-醇（2.44%）。

d處理組共分離鑒定出79 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（19.62%）、反式香葉醇（17.32%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（8.28%）、水楊酸甲酯（7.11%）、脫氫芳樟醇（5.78%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（3.97%）、苯乙醛（3.81%）、苯乙醇（2.74%）、苯甲醛（2.11%）、α-萜品醇（1.98%）。

e處理組共分離鑒定出72 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（17.77%）、反式香葉醇（15.79%）、水楊酸甲酯（8.59%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（8.31%）、脫氫芳樟醇（5.46%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（4.53%）、苯乙醛（4.41%）、苯乙醇（3.05%）、α-萜品醇（2.13%）、苯甲醛（1.97%）。

f處理組共分離鑒定出77 種香氣化合物，相對含量排前10 位的分別是β-芳樟醇（18.73%）、反式香葉醇（17.54%）、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇（8.76%）、水楊酸甲酯（8.03%）、脫氫芳樟醇（5.57%）、苯乙醛（4.24%）、3-甲基-7-甲基二環(huán)[3.3.1]壬烷-3-醇（3.85%）、苯乙醇（2.89%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化-2H-吡喃-3-醇（2.08%）、α-萜品醇（2.06%）。

2.2 不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶樣揮發(fā)性成分比較

將6 個處理紅茶樣品的揮發(fā)性成分按照化合物種類進(jìn)行分類，見表2。結(jié)果表明，6 個樣品揮發(fā)性成分在組成上存在高度相似的特點。但在相對含量上，隨著通氧時間的延長，存在上升或下降的整體趨勢。

6 個樣品揮發(fā)性成分比例均以醇類最高，隨著通氧時間的延長，醇類物質(zhì)表現(xiàn)出上升的整體趨勢。6 個樣品醇類相對含量均以β-芳樟醇最高，β-芳樟醇、反式香葉醇及α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇一起構(gòu)成了6 個紅茶樣品醇類物質(zhì)的主體，其中a處理組三者之和占整個醇類物質(zhì)的76.12%，b處理組為67.58%，c處理組為55.97%，d處理組為65.12%，e處理組為61.91%，f處理組為64.48%。

6 個樣品揮發(fā)性成分比例第2高的是酯類物質(zhì)，隨著通氧時間的延長，酯類物質(zhì)表現(xiàn)出下降的整體趨勢。6 個樣品酯類相對含量均以水楊酸甲酯最高。其中，a處理組水楊酸甲酯占整個酯類物質(zhì)的93.25%，b處理組為96.68%，c處理組為93.87%，d處理組為79.62%，e處理組為82.28%，f處理組為80.62%。其他檢測出的酯類物質(zhì)相對含量較低，且不同樣品檢測出的酯類物質(zhì)組成差異較大。

6 個樣品揮發(fā)性成分比例第3高的是醛類物質(zhì)，隨著通氧時間的延長，醛類物質(zhì)表現(xiàn)出上升的整體趨勢。6 個樣品醛類相對含量均以苯乙醛最高，a處理組為3.12%，b處理組為4.52%，c處理組為3.56%，d處理組為3.81%，e處理組為4.41%，f處理為4.24%，分別占醛類物質(zhì)的40.68%、45.89%、34.70%、27.63%、45.79%、38.76%，其他相對含量較高的醛類物質(zhì)包括苯甲醛、癸醛、α-檸檬醛等。

6 個樣品檢測出的碳?xì)漕惢衔锵鄬枯^高，a處理組為2.51%，b處理組為6.21%，c處理組為6.61%，d處理組為3.65%，e處理組為8.01%，f處理組為5.53%。其中β-月桂烯、2-菠烯相對含量最高。

6 個樣品檢測出的酮類物質(zhì)，a處理組為2.37%，b處理組為1.76%，c處理組為3.36%，d處理組為2.51%，e處理組為3.19%，f處理組為3.10%。6 個樣品均以順式茉莉酮、β-紫羅酮相對含量最高，且隨著通氧時間的延長2 種物質(zhì)均呈現(xiàn)出上升的整體趨勢。

6 個樣品檢測出的酸類物質(zhì)較少，共檢出2 種酸類物質(zhì)，分別為橙花酸、3-（2-異丙基-5-甲苯）-2-異丁酸。橙花酸僅b處理組檢出，3-（2-異丙基-5-甲苯）-2-異丁酸僅e處理組檢出。

6 個樣品檢測出的含氮類化合物僅1 種，為咖啡堿，且a處理組樣品未檢出。

6 個樣品檢測出的雜氧化合物較少，共4 種，檢出種類隨通氧時間延長，呈現(xiàn)出增多的趨勢。

表 2 不同通氧發(fā)酵加工工藝紅茶樣品香氣成分比例組成Table 2 Chemical classes of the aroma components identified in black tea samples with oxygen ventilation for different periods of time during the fermentation process ess %

3 討論與結(jié)論

本研究涉及的6 個樣品檢測出的揮發(fā)性成分主要以醇類為主，相對含量占60%以上，其次為酯類、醛類、碳?xì)漕惣巴?。與文獻(xiàn)[3-7,14]研究結(jié)論相似。檢測出的紅茶特征香氣成分，醇類以β-芳樟醇為主，還包括反式香葉醇及α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇等。酯類以水楊酸甲酯為主。醛類以苯乙醛為主。碳?xì)漕愐驭?月桂烯、2-菠烯為主。酮類以順式茉莉酮、β-紫羅酮為主。已有研究[6-8,13]均表明出香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇和苯乙醇是祁門紅茶的特征性香氣物質(zhì)。與本研究存在一定差異。任洪濤等[11]研究表明，苯甲醛、苯乙醛是紅茶醛類香氣成分的特征物質(zhì)。與本研究結(jié)果相似。研究[26]表明，紅茶酯類香氣成分的特征物質(zhì)包括水楊酸甲酯、二氫海癸內(nèi)酯等，酮類特征香氣成分包含茶螺烯酮、紫羅酮等，與本研究結(jié)果類似。

本研究涉及6 個不同通氧加工工藝紅茶樣品檢測出的主體揮發(fā)性成分中化合物類型及相對含量均高度相似。但隨著通氧時間的延長，檢測出揮發(fā)性成分的數(shù)量呈整體上升趨勢，自然發(fā)酵共分離鑒定出47 種香氣化合物，通氧45 min處理共分離鑒定出53 種香氣化合物，通氧60 min處理共分離鑒定出48 種香氣化合物，通氧75 min處理共分離鑒定出79 種香氣化合物，通氧90 min處理共分離鑒定出72 種香氣化合物，通氧105 min處理共分離鑒定出77 種香氣化合物。但增加的香氣化合物相對含量很低。

在同一茶樹品種條件下，紅茶通氧發(fā)酵加工工藝不會改變紅茶主要香氣成分的組成結(jié)構(gòu)；通氧發(fā)酵加工工藝，改變了紅茶發(fā)酵過程中化學(xué)反應(yīng)的外部環(huán)境，有利于增加紅茶香氣化合物的種類；茶葉的香氣與茶樹品種、自然環(huán)境與栽培條件、加工工藝和外源誘導(dǎo)等多種因素有關(guān)，部分微量成分卻對茶葉香氣品質(zhì)起決定作用，本研究通氧發(fā)酵工藝樣品檢測出多種微量揮發(fā)性成分，其與紅茶香氣品質(zhì)的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。本研究采用面積歸一法進(jìn)行定量分析，不能確定通氧發(fā)酵加工工藝對紅茶香氣成分質(zhì)量的影響作用。

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Analysis of Aroma Compounds in Black Tea Ventilated with Oxygen for Different Durations during the Fermentation Process by Head Space-Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

PAN Ke1,2, FENG Lin3, CHEN Juan2, DU Xiao1,*
(1. College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China； 2. Guizhou Tea Research Institute, Guiyang 550006, China； 3. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

This paper analyzes the aroma components in black tea with different durations of oxygen ventilation during the fermentation process by the combination of head space-solid-phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). The results showed that 47 kinds of aroma compounds were identified in naturally fermented black tea while 53, 48, 79, 72 and 77 kinds of aroma compounds were identified in fermented black tea samples with oxygen ventilation for 45, 60, 75, 90 and 105 min, respectively. Alcohols were the dominant aroma components in all the six samples and their contents accounted for more than 60% of the total aroma components, followed sequentially by esters, aldehydes, and ketones hydrocarbon. Comparative analysis indicated that oxygen ventilation during the fermentation process did not change the main aroma components of black tea from the same tea cultivar and even resulted in the formation of more aroma compounds.

black tea； fermentation with oxygen ventilation； head space-solid phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)； aroma

S571.1

A

1002-6630（2015）08-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201508033

2014-09-01

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（20133013）

潘科（1984—），男，副研究員，博士研究生，主要從事茶葉加工研究。E-mail：panke840215@126.com

*通信作者：杜曉（1963—），男，教授，博士，主要從事茶葉質(zhì)量檢驗研究。E-mail：duxian@vip.163.com