薛 蕾，隋志偉*，張 玲，王 晶，傅博強，劉瑛穎，郝 林

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

薛 蕾1,2，隋志偉1,*，張 玲1，王 晶1，傅博強1，劉瑛穎1，郝 林2

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030800）

將金黃色葡萄球菌添加到復(fù)合保護劑中，經(jīng)凍干制備成干粉狀標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過比較凍干前后活菌數(shù)來驗證保護劑保護效果，并研究標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明復(fù)合保護劑的保護率達(dá)到51.74%，可以在凍干過程中有效保護菌體，制備的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，可以穩(wěn)定保存半年。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于食品檢測實驗室質(zhì)量控制和食品中金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果的評價。

金黃色葡萄球菌；冷凍干燥；保護劑；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

世界衛(wèi)生組織曾公告，食源性疾病和食品污染已成為世界性公共衛(wèi)生問題，保證食品中低于致病量的致病性微生物是食品安全工作的重要方面[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一。

美國疾病控制與預(yù)防中心報告顯示，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占第2位，僅次于大腸桿菌，占整個細(xì)菌性食物中毒的33%[2]。近年來，我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已居第四位[3]。2011年我國新出臺的GB 19295—2011《速凍面米制品》和2014年7月1日即將實施的GB 29921—2013《食品中致病菌限量》都對金黃色葡萄球菌檢測作出了明確規(guī)定，不僅加大了對金黃色葡萄球菌的監(jiān)測力度，也改變了過去“不得檢出”的定性判斷，體現(xiàn)了我國食品安全微生物檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)向限量測量發(fā)展的方向。因此，針對金黃色葡萄球菌的準(zhǔn)確測量，越來越受到有關(guān)專家和學(xué)者的關(guān)注[4]。

在食品安全領(lǐng)域，國際、國內(nèi)針對微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制才剛剛起步，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)極其匱乏，在研制金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面甚至是空白[5-7]。因此有必要研制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以保證金黃色葡萄球菌定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠。本研究目的是要建立金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作方法，并研制得到穩(wěn)定性較好、重復(fù)性較高的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，符合我國國情、也符合國際微生物計量發(fā)展的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphlyococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC，菌株編號10384）由中國計量科學(xué)研究院保存；Baird-Parker培養(yǎng)基、亞碲酸鉀卵黃增菌液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、無菌生理鹽水（0.85%） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；脫脂奶粉雀巢有限公司；海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸鈉、麥芽糊精、抗壞血酸鈉 美國Sigma公司；棕色西林瓶（經(jīng)高壓滅菌處理后使用） 深圳市寶安區(qū)沙井博海玻璃制品廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Beta1-8 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；HWS-400恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HZQ-X160恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；CR21G高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；Milli-Q Advantage純水儀 美國Millipore公司；DensiChek麥?zhǔn)媳葷醿x 法國梅里埃公司；CP225D電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種復(fù)活、鑒定與培養(yǎng)

將冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株在營養(yǎng)瓊脂上劃線復(fù)活，37 ℃，培養(yǎng)18～24 h。從平板上挑取單個金黃色葡萄球菌菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃，培養(yǎng)18～24 h，取菌液接種到Baird-Parker培養(yǎng)基上，37 ℃至長出菌落后，隨機挑取10 個菌落進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡觀察，細(xì)菌排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5～1 μm則初步鑒定為金黃色葡萄球菌，再接著做血漿凝固酶實驗，如呈現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積一半者則最終確定為金黃色葡萄球菌[8]。

1.3.2 制備方法

在冷凍干燥的過程中，溫度降低和水分蒸發(fā)（冰晶體的形成）對菌種活性會造成很大的影響，為了提高菌種在噴霧過程中的存活率，向菌液中加入保護劑是一種非常有效的方法，保護劑的種類繁多，一般分為4大類：滲透型抗凍劑、非滲透型抗凍劑、抗氧化劑、膠體[9]。不同比例的保護劑，對樣品的作用也有很大的影響[10]。

本實驗通過參考前人[11-15]研究的細(xì)菌保護劑配方，最終選擇可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、磷酸鹽緩沖液作為菌種復(fù)方冷凍干燥保護劑。保護劑材料經(jīng)輻射劑量為4 kGy的60Co進(jìn)行輻照滅菌。冷凍干燥機和配件在使用前經(jīng)消毒滅菌處理。

將金黃色葡萄球菌添加到保護劑（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液100 mL＋可溶性淀粉20 g＋海藻糖5 g＋脫脂奶粉5 g＋谷氨酸鈉1.5 g＋麥芽糊精7 g＋抗壞血酸鈉0.05 g）中混合均勻，用移液器分裝至棕色西林瓶中，37 ℃條件下孵育7 h。將隔板與分裝好的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-70 ℃冰箱中預(yù)凍4 h[16]以上后，選擇隔板最終溫度20 ℃，0.370 mbar上機冷凍干燥36～48 h。充氮氣后，將凍干好的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)壓蓋密封。隨機抽取8 瓶樣品，對冷凍干燥前后的活菌數(shù)進(jìn)行測定，得出存活率（存活率/%=冷凍干燥后活菌數(shù)/冷凍干燥前活菌數(shù)×100）。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水分測定

經(jīng)凍干后的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機抽取8 瓶樣品，采用稱重法進(jìn)行水分測定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

隨機抽取15 瓶金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每瓶重復(fù)檢測3 次，采用平板計數(shù)方法進(jìn)行均勻性測定，并采用方差分析法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察主要涉及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運輸過程中的穩(wěn)定性、客戶端的貯存條件和使用有效期。穩(wěn)定性考察溫度設(shè)置為-20 ℃，分別在0、7、14、21、30、60、90、120、150、180 d隨機選取3 瓶采用平板計數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)菌活菌數(shù)的變化情況，描繪出特性量值Y與時間X的關(guān)系，擬合成一條直線，通過公式（1）計算斜率b1，通過公式（2）計算斜率b1不確定度s（b1）。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的定值

隨機抽取9 瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平均分成3 組，分別由3 個人獨立完成平板計數(shù)。每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用2 mL無菌生理鹽水充分溶解凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將每瓶溶解后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)取1 mL，沿管壁緩慢注入盛有9 mL無菌磷酸鹽緩沖液的無菌試管中，換用1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制備成1∶10的樣品勻液，依次按照1∶10比例系列稀釋。選擇3 個適宜稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取樣品勻液以0.3、0.3、0.4 mL的接種量分別加入3 塊Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣[17]。涂布后，將平板平放在培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)1 h后，倒置于培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)45～48 h。選擇典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板進(jìn)行計數(shù)[5]。每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)3 次，計算平板計數(shù)平均值作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物菌種的鑒定和凍干存活率

隨機挑取活化后接種到Baird-Parker培養(yǎng)基的10 個菌落，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物菌種均為金黃色葡萄球菌的，其純度為100%。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)凍干后測其活含菌量，結(jié)果如表1所示。

表 1 金黃色葡萄球菌凍干存活率結(jié)果Table 1 Freeze-drying survival results of Staphylococcus aurreeuuss

從表1可以看出，復(fù)合保護劑對金黃色葡萄球菌凍干前后的保護率為51.74%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水分

采用稱重法對冷凍干燥后的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行水分測定，測定結(jié)果表明金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的水分含量平均值為1.40%，含水量低于3%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

采用F檢驗[18]對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗。以每瓶3 個重復(fù)，共獲得45 個數(shù)據(jù)。從表2可以看出，組內(nèi)均勻性的F檢驗均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，證明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在組內(nèi)不存在顯著性差異。由樣品的不均勻性所引起的誤差與測定誤差相比，可以忽略不計，表明樣品均勻性良好。

表 2 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性實驗數(shù)據(jù)Table 2 Homogeneity of the reference material of Staphylococcus aureus eus

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存在4 ℃，每次任取3 瓶，按1.3.6節(jié)中的定值方法測定活菌數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)活菌數(shù)隨時間的變化確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖1。

圖 1 金黃色葡萄球菌活菌數(shù)隨時間的變化Fig.1 Change in the number of viable Staphylococcus aureus during storage

由圖1可知，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在前21 d內(nèi)不穩(wěn)定，從0 d的42 222 CFU/mL下降到16 666 CFU/mL，從第21天后穩(wěn)定在13 000 CFU/mL左右。將第30～180天的活菌數(shù)進(jìn)行擬合直線，通過計算發(fā)現(xiàn)｜b1｜＜t0.95（n-2）×s（b1），表明斜率是不顯著的，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從30～180 d穩(wěn)定性良好。金黃色葡萄球菌在凍干過程中較大多數(shù)的菌受到機械損傷和化學(xué)損傷在短時間內(nèi)出現(xiàn)死亡，從而導(dǎo)致在穩(wěn)定性實驗初期會出現(xiàn)活菌數(shù)的明顯下降過程。而沒有受到損傷或損傷較小的菌則能夠長期保存下來，并在半年的時間內(nèi)保持穩(wěn)定，因此凍干后的金黃色葡萄球菌會出現(xiàn)穩(wěn)定性曲線先抑后平穩(wěn)的現(xiàn)象[19-20]。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及不確定度評定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的確認(rèn)

按1.3.6節(jié)中的定值方法計算平板計數(shù)平均值作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果（表3），金黃色葡萄球菌定值結(jié)果平均值為13 259 CFU/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.12%。

表 3 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果Table 3 Certified values of the reference material of Staphylococcus aurreeuuss

2.5.2 定值結(jié)果的不確定度評定

金黃色葡萄球菌定值結(jié)果的總不確定度由3 部分組成。第1部分是通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計學(xué)方法計算出A類不確定度uA。第2部分是通過對測量影響因素的分析，以非統(tǒng)計分析的方法評定出其大小的B類不確定度uB，它的主要來源包括：吸管帶來的不確定度、溶液稀釋帶來的不確定度等。第3部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性帶來的不確定度ubb和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性所帶來的不確定度uS。將這幾部分不確定度合成就構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)值的合成不確定度u，擴展不確定度U =ku（k=2，置信概率95%）（表4）。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為（13 259±868）CFU/mL。

表 4 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及不確定度評定結(jié)果Table 4 Certified values and uncertainty evaluation of the reference material of l of Staphylococcus aureus reus CFU/mL

3 討 論

隨著新國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29921—2013[21]即將實施，針對金黃色葡萄球菌的準(zhǔn)確測量，越來越受到有關(guān)專家和學(xué)者的關(guān)注。在食品安全領(lǐng)域，國際、國內(nèi)針對微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制才剛剛起步，目前國際上歐洲標(biāo)準(zhǔn)局只研制了用于活菌平板計數(shù)的定量微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli），國內(nèi)已經(jīng)獲得國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批號的只有食品微生物凍干樣品菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100044）和魚粉菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100045），新近研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也只有雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和乳粉中阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。因此，微生物活菌定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)極其匱乏，有關(guān)金黃色葡萄球菌活菌計數(shù)的定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究還是空白。

本實驗研制的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性，多次測試結(jié)果無顯著差異。由于在冷凍過程中，溫度降低和水分蒸發(fā)（冰晶體的形成）對菌種活性會造成很大的傷害，為了提高菌種在冷凍干燥過程中的存活率，向菌液中加入保護劑是一種非常有效的方法。通過單因素試驗測試，某些單一保護劑的保護率低于10%，因此選擇復(fù)合保護劑來進(jìn)行金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。此外，在研制過程中發(fā)現(xiàn)，微生物保護劑在凍干前的孵育尤為重要，保護劑只有與菌體充分融合且均勻分布在細(xì)菌細(xì)胞壁兩側(cè)，才能夠在凍干過程中增強菌體對高滲透壓和干燥條件下的忍耐力。在雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制[7]中，復(fù)合保護劑的保護率要比單一保護劑保護率提高1 倍；而在乳粉中阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制[22]中，凍干前后菌種保護率約為54.7%。恰當(dāng)?shù)膹?fù)合凍干保護劑可以使懸浮的微生物冷凍時形成完全或幾乎完全玻璃化態(tài)，減少物料在凍干及保存過程中的損害，復(fù)合保護劑對金黃色葡萄球菌凍干前后的保護率為51.74%，此與雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[7]和乳粉中阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[22]文獻(xiàn)中保護劑的保護率基本一致。

金黃色葡萄球菌在凍干過程中，由于大多數(shù)菌受到機械和化學(xué)損傷在短時間內(nèi)出現(xiàn)死亡，極易導(dǎo)致在穩(wěn)定性實驗初期出現(xiàn)活菌數(shù)明顯下降的過程。在凍結(jié)過程中，細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)外的水分固化，所有的流動體都會以固態(tài)、晶態(tài)或玻璃態(tài)存在[23]。冰晶生長產(chǎn)生的機械力量會引起細(xì)菌損傷，一般冰晶越大，細(xì)胞壁越易破裂，造成細(xì)菌死亡；復(fù)水時冰晶會發(fā)生重結(jié)晶，再次損害細(xì)胞壁。為了減少機械損傷，保護劑的添加尤為必要。化學(xué)保護劑容易與細(xì)菌內(nèi)外的水分子結(jié)合發(fā)生水合作用，使溶液黏性增加，弱化了水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護目的。但是水的凍結(jié)使細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)的液體逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加，細(xì)菌內(nèi)外滲透壓的存在導(dǎo)致細(xì)菌脫水，細(xì)菌內(nèi)的蛋白質(zhì)對高濃度的電解質(zhì)極為敏感，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進(jìn)而喪失其功能，引起細(xì)菌的死亡[24-25]。因此，凍干粉中的金黃色葡萄球菌在這個凍干過程中不可避免地因為損傷而死亡，其活菌數(shù)量在經(jīng)過3 周的衰減后，那些沒有受到損傷或損傷較小的菌則能夠長期保存下來，并在半年的時間內(nèi)保持穩(wěn)定。因此凍干后的金黃色葡萄球菌會出現(xiàn)穩(wěn)定性曲線先抑后平穩(wěn)的現(xiàn)象[19-20]，這與雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[7]和乳粉中阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[21]中的報道是基本一致的。

該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在金黃色葡萄球菌檢測中起著測量標(biāo)準(zhǔn)的作用，有利于食品中金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果的準(zhǔn)確和量值統(tǒng)一，更有利于保證食品質(zhì)量與安全，所做的金黃色葡萄球菌制備研究工作將對食品致病菌檢測用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備以及剛剛開始的微生物計量工作具有一定的參考價值，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于實驗室質(zhì)量控制及室間比對，保證我國食品安全質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)的可靠、可比與國際互認(rèn)[26]。

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Preparation of Staphylococcus aureus Reference Material

XUE Lei1,2, SUI Zhiwei1,*, ZHANG Ling1, WANG Jing1, FU Boqiang1, LIU Yingying1, HAO Lin2
(1. National Institute of Metrology, Beijing 100029, China；2. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030800, China)

A reference material of Staphylococcus aureus was prepared by freeze-drying Staphylococcus aureus cells in the presence of a composite cryoprotectant. The efficacy of the cryoprotectant was verified by comparing the numbers of viable bacterial cells before and after the freeze-drying, and the homogeneity and stability of the standard substance were studied. The results showed that the composite protective agent could protect 51.74% of the viable bacterial cells. The homogeneity and stability after six months of storage of the reference material of Staphylococcus aureus were good. The reference material can be used for quality control in food testing laboratories and evaluation of food test results.

Staphylococcus aureus； freeze-drying； protectant； reference material

TS207.4

A

1002-6630（2015）08-0044-05

10.7506/spkx1002-6630-201508008

2014-06-11

國家質(zhì)檢總局食品安全專項（ASPAQ1304）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAK12B05）

薛蕾（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)生物技術(shù)。E-mail：ysqwxl@163.com

*通信作者：隋志偉（1980—），男，副研究員，博士，研究方向為微生物測量方法研究與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制。E-mail：suizhw@nim.ac.cn