阿司匹林聯合阿托伐他汀對腦卒中大鼠腦組織神經生長相關蛋白43與血管內皮生長因子表達的影響及治療老年急性缺血性腦卒中的療效

孟明張春梅趙旭偉張麗艷張亞男

(齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內二科，黑龍江齊齊哈爾161042)

摘要〔〕目的探討阿司匹林聯合阿托伐他汀治療老年急性缺血性腦卒中患者臨床療效以及分子機制。方法收集2010年4月至2014年1月在該院入住確診的急性缺血性腦梗死患者124例，隨機分為對照組58例、觀察組66例，對照組給予阿司匹林，觀察組給予阿托伐他汀聯合阿司匹林，連續(xù)給藥6個月。動物試驗：將左側大腦中動脈阻斷(MCAO)模型大鼠分為模型組、阿司匹林組、阿伐他汀組與阿司匹林聯合阿伐他汀組，每組20只。對照組20只，僅接受假手術。結果臨床試驗：兩個組別治療前，美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分無顯著差異(P>0.05)，治療后兩個組別NIHSS評分明顯降低(P<0.05)，與對照組比較，觀察組NIHSS顯著降低(P<0.05)。治療6個月內，對照組缺血性腦血管事件發(fā)生6例，病死2例；觀察組缺血性腦血管事件發(fā)生1例，病死1例，明顯低于對照組(P<0.05)。動物試驗：與對照組比較，模型組的神經生長相關蛋白(GAP)43、血管內皮生長因子(VEGF)和腦梗死面積顯著增高(P<0.05)，阿司匹林組、阿伐他汀組和阿司匹林聯合阿伐他汀組均可降低MCAO大鼠腦內GAP43、VEGF表達和腦梗死面積(P<0.05)；阿伐他汀組與阿司匹林組GAP43、VEGF表達和腦梗死面積無顯著差異(P>0.05)；與阿司匹林組和阿伐他汀組比較，阿司匹林聯合阿伐他汀組可顯著降低MCAO大鼠腦內GAP43和VEGF表達與MACO大鼠腦內梗死面積(P<0.01或P<0.05)。結論阿托伐他汀聯合阿司匹林治療老年急性缺血性腦卒中效果良好，可能與降低患者腦內GAP43與VEGF表達、增強腦皮質功能可塑性有關。

關鍵詞〔〕阿托伐他??；阿司匹林；急性缺血性腦卒中；神經生長相關蛋白43；血管內皮生長因子

中圖分類號〔〕R973〔

第一作者：孟明(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事神經內科疾病研究。

目前腦梗死的治療主要針對溶栓改善缺血區(qū)血液循環(huán)，較少關注促進神經組織修復和功能重建的藥物。神經生長相關蛋白(GAP)-43對神經的生長、發(fā)育、再生以及維持突觸功能和釋放遞質均有重要作用，是神經再塑與再生的分子標志物。血管內皮生長因子(VEGF)是目前發(fā)現的血管發(fā)生及成體后血管再生的最關鍵因子。GAP-43與VEGF在腦缺血中發(fā)揮重要作用。阿司匹林(ASA)聯合阿托伐他汀治療急性缺血性腦梗死，旨在抗凝和降低血脂，效果優(yōu)于ASA或他汀類單獨使用〔1〕；但較少研究兩者與腦神經再塑或腦血管再生的關系。本課題擬考察阿托伐他汀聯合ASA治療老年急性缺血性腦卒中的臨床療效以及對腦內GAP-43與VEGF表達的影響。

1資料與方法

1.1臨床試驗

1.1.1研究對象經院內倫理委員會同意，收集2010年4月至2014年1月在我院入住，經MRI或CT確診符合急性腦梗死診斷標準的急性缺血性腦梗死患者124例，采用隨機數字表法分為對照組58例，觀察組66例，均簽署知情同意書，兩個組別的一般情況無顯著差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。均排除嚴重癡呆癥或有精神病史者。

表1　兩組患者的一般資料比較 ± s)

1.1.2治療兩組患者均給予急性腦梗死常規(guī)治療，同時治療原發(fā)病，控制血壓、血糖。對照組給予拜阿司匹林腸溶片(德國拜耳醫(yī)藥保健公司生產，規(guī)格100 mg/片，批號：BAT4XF5)口服，1片/d，1次/d；治療組在對照組基礎上給予阿托伐他汀(大連輝瑞制藥有限公司，規(guī)格20 mg/片，批號：55837016)口服，1片/d，1次/d。兩個組別出院后繼續(xù)服用，療程6個月。

1.1.3檢測指標檢測治療前后美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分和治療6個月內缺血性腦血管事件復發(fā)情況。NIHSS分數越高說明患者狀態(tài)越差。

1.2動物試驗

1.2.1受試動物清潔級老年SD大鼠，雄性，體重500～550 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度24℃～28℃，相對濕度45%～65%，照明12 h/d，實驗前適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2.2受試藥物、試劑與儀器設備受試藥物同1.1.2。兔抗大鼠 GAP-43 多克隆抗體、兔抗大鼠VEGF多克隆抗體，SP9000 超敏試劑盒，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，多聚甲醛、水合氯醛、碘伏、酒精、生理鹽水；奧林巴斯BX51顯微鏡，電動牙科鉆、TCS-100電子秤、ES-2100S電子秤、切片機、生物組織包埋機、生物組織自動脫水機和手術器械等。

1.2.3左側大腦中動脈阻斷(MCAO)模型的制備大鼠禁食不禁水12 h，按體重給予水合氯醛進行腹腔注射麻醉，大鼠右側臥位固定手術臺，暴露左側顳頂部，碘伏消毒，切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨翼板，牙鉆經顳骨翼板鉆至硬腦膜，暴露大腦中動脈近端，用電凝器凝閉嗅束近端至大腦下靜脈間的大腦中動脈，依次縫合顳肌與皮膚，腹腔注射硫酸慶大霉素預防感染，電熱毯保溫至蘇醒，正常飲水攝食。

1.2.4分組與給藥將MCAO大鼠分為模型組、阿司匹林、阿伐他汀與阿司匹林聯合阿伐他汀組，每組20只。對照組20只，僅麻醉后暴露顳骨翼板后縫合，腹腔注射硫酸慶大霉素。模型組與對照組灌胃生理鹽水，2 ml/100 g，其余三組予相應藥物。連續(xù)給藥14 d。

1.2.5腦組織的病理改變及免疫組化檢測各組大鼠于給藥第15天水合氯醛腹腔注射麻醉，剪開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟，心尖處開口，9#針頭插入左心室，灌注氯化鈉注射液，剪開右心耳引流血液，至右心耳流出液為無色透明，替換多聚甲醛灌注固定，固定后立即取腦，置于多聚甲醛再固定、脫水、包埋和切片，進行免疫組化。光鏡下選取免疫組化切片觀察缺血區(qū)和周圍視野，記錄視野內陽性細胞數，重復5個不同視野，取平均值。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS15.0軟件，組間比較采用χ2檢驗或方差分析。

2結果

2.1兩組治療前后NIHSS評分比較和治療6個月內缺血性腦血管事件復發(fā)情況比較兩組治療前，NIHSS評分無顯著差異(對照組：7.6±2.1，觀察組7.7±1.8，P>0.05)，治療后兩個組別NIHSS評分明顯降低(P<0.05)，與對照組(3.8±1.1)相比，觀察組NIHSS評分(3.3±1.2)顯著降低(P<0.05)。治療6個月內對照組缺血性腦血管事件發(fā)生6例，病死2例；觀察組缺血性腦血管事件發(fā)生1例，病死1例，明顯低于對照組(P<0.05)。

2.2各組大鼠腦內GAP43和VEGF表達比較鏡下顯示，大鼠腦內GAP43和VEGF陽性表達表現為棕黃色或棕黑色顆粒狀。與對照組比較，模型組的GAP43和VEGF顯著增高(P<0.05)，阿司匹林組、阿伐他汀組和阿司匹林聯合阿伐他汀組均可降低MCAO大鼠腦內GAP43和VEGF表達(P<0.05)；與阿托伐他汀組比較，阿司匹林組降低GAP43和VEGF的趨勢較強，但無顯著差異(P>0.05)，與阿司匹林組和阿托伐他汀組比較，阿司匹林聯合阿托伐他汀組可顯著降低MCAO腦內GAP43和VEGF表達(P<0.05)，見表2，圖1，圖2。

表2　各組大鼠腦內GAP43和VEGF表達及

與模型組比較：1)P<0.05；與阿司匹林組比較：2)P<0.05；與阿伐他汀組比較：3)P<0.05

2.3各組大鼠腦內梗死面積比較與MCAO模型組比較，阿司匹林組、阿托伐他汀組和阿司匹林聯合阿托伐他汀組明顯降低MACO大鼠腦內梗死面積(P<0.01)。阿司匹林組和阿托伐他汀組降低MACO大鼠腦內梗死面積相當(P>0.05)，與阿司匹林組和阿托伐他汀組比較，阿司匹林聯合阿托伐他汀組可顯著降低MACO大鼠腦內梗死面積(P<0.05)。見表2。

圖1　各組大鼠腦內GAP43表達(×400)

圖2　各組大鼠腦內VEGF表達(×200)

3討論

缺血半暗帶區(qū)域的腦組織缺血程度輕，病灶以及病灶周圍的中樞神經系統(tǒng)在結構和功能上存在部分重建或恢復的可能性，因此挽救保護半暗帶可逆的神經元對于改善缺血性腦血管病預后具有顯著意義〔2〕。

ASA是一種非選擇性地環(huán)氧化酶(COX)抑制劑，它的抗炎途徑有兩條，可通過抑制 COX-1，阻斷介導血小板活化的血栓烷 A2 的合成；也可通過抑制COX-2，減少基質金屬蛋白酶(MMPs)和前列腺素類物質的釋放，從而減緩細胞外基質的降解、細胞遷移和炎性物質的合成。阿托伐他汀屬于他汀類藥物，是3-羥基-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能抑制HMG-CoA向甲羥戊酸轉化，可降低總膽固醇合成，增加血清低密度脂蛋白(LDL)清除，抑制甘油三酯(TG)生成，升高HDL，減少MMPs產生，抑制巨噬細胞的活性，改善內皮依賴性血管擴張功能，對內皮細胞具有保護作用〔3～5〕。研究顯示ASA聯合阿伐他汀兩者聯合較單用治療腦卒中效果更佳〔6，7〕。

GAP-43由胞體合成，屬Ca2+依賴性鈣調素結合蛋白，廣泛參與中樞和外周神經的生長、再生及功能發(fā)育，是神經元生長期的重要因子。作為神經生長/再生的標志物，當腦內出現缺氧缺血的狀態(tài)，突觸重建程序被啟動，GAP-43表達升高，當新的突觸建立聯系后，GAP-43表達顯著降低，或呈微量或無陽性表達〔8〕。血管新生即在原有血管基礎上生出新的毛細血管，微血管的重建可促進腦卒中恢復，因此半暗帶區(qū)血管內皮細胞增殖一定程度上決定腦卒中患者病態(tài)發(fā)展和存活。VEGF 是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能因子，既是血管發(fā)生因子也是神經發(fā)生與保護因子，當腦血管閉塞形成缺血區(qū)時，可促進缺血區(qū)新的血管再生，關聯血管新生與神經發(fā)生的重要紐帶，原因有以下幾點〔9，10〕：(1)VEGF的神經元保護作用：缺血缺氧可誘導VEGF和VEGFR-2/Flk受體表達，VEGF通過與VEGFR-2/Flk受體結合，直接發(fā)揮神經營養(yǎng)和神經保護作用。(2)VEGF對膠質細胞的保護作用：體外試驗顯示外源性VEGF干預缺氧培養(yǎng)的星形膠質細胞，VEGF與受體Flk-1結合發(fā)揮對星形膠質細胞的缺氧保護作用。(3)VEGF對神經的再生作用：VEGF可上調Noggin表達促進大鼠腦缺血后紋狀體內神經干細胞增殖、遷移和分化。(4)VEGF的促進血管新生作用：在缺氧或缺血狀態(tài)下，可刺激血管內皮細胞分裂增殖，進一步形成新血管。本課題結果顯示ASA聯合洛伐他汀可顯著可降低VEGF表達，保護腦缺血半暗區(qū)神經，促進血管和神經再生，同時改善血流，可影響神經生理功能恢復。

本課題結果顯示，與ASA或洛伐他汀比，ASA聯合洛伐他汀可顯著降低大鼠腦GAP-43和VEGF的表達，提示兩藥合用可加速GAP-43和VEGF表達降低進程，促進大鼠損傷區(qū)軸突的生長與再生、血管再生，對損傷的神經和血管有顯著地恢復作用。但阿托伐他汀聯合ASA影響GAP-43和VEGF表達的機制有待進一步研究。

4參考文獻

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9Kim OJ，Hong SH，Oh SH，etal.Association between VEGF polymorphisms and homocysteine levels in patients with ischemic stroke and silentbrain infarction〔J〕.Stroke,2011；42(9)：2393-402.

10宋晶晶.苯扎貝特對大鼠腦缺血再灌注損傷HIF-1α、VEGF表達的影響〔D〕.鄭州：鄭州大學碩士論文，2012.

〔2014-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)