不同濃度尿酸對(duì)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

王云開(kāi)周金華

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討尿酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)功能影響及可能機(jī)制分泌纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)蛋白的作用和可能的信號(hào)通路。方法分別用不同尿酸濃度〔蒸餾水(對(duì)照組)、119、238、476、952 μmol/L〕(n=6)干預(yù)體外培養(yǎng)的HUVECS 24 h，觀察其形態(tài)、增殖、培養(yǎng)液中PAI-1蛋白的影響。觀察476 μmol/L尿酸干預(yù)培養(yǎng)時(shí)，不同時(shí)間(1、3、6、12、24 h)對(duì)HUVECs培養(yǎng)液PAI-1蛋白及不同時(shí)間(15、30、60、120 min)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2磷酸化水平的影響。用ERK1/2通路阻滯劑(PD98059，20 μmol/L)阻斷尿酸誘導(dǎo)HUVECS分泌PAI-1蛋白。結(jié)果與對(duì)照組比較，濃度476、952 μmol/L尿酸使細(xì)胞增殖減少，培養(yǎng)液中PAI-1蛋白增加(P<0.05)。濃度為476 μmol/L尿酸作用HUVECs不同時(shí)間(1、3、6、12、24 h)對(duì)PAI-1蛋白的影響呈時(shí)間依賴性。不同時(shí)間(15、30、60、120 min)促ERK1/2磷酸化水平升高，與0 min組比較(P<0.05)。預(yù)先給予PD98059(20 μmol/L)作用后，尿酸476 μmol/L+ PD98059(20 μmol/L)能阻斷PAI-1蛋白生成(P<0.05)。結(jié)論尿酸抑制HUVECs增生，增加PAI-1蛋白表達(dá)，同時(shí)增加ERK1/2磷酸化水平，ERK1/2通路阻滯劑PD98059部分抑制尿酸誘導(dǎo)HUVECS分泌PAI-1蛋白，尿酸通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)HUVECS分泌PAI-1蛋白。

關(guān)鍵詞〔〕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞外信號(hào)通路1/2；纖溶酶原激活物抑制劑-1

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R322.1〔

第一作者：王云開(kāi)(1963-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病及高血壓研究。

血清尿酸濃度的升高與氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞增殖等有密切聯(lián)系，認(rèn)為高尿酸是心血管事件的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔1～3〕。正常濃度的尿酸在人體血漿中是重要的抗氧化劑，60%的尿酸具有清除自由基的功能。但尿酸濃度升高到一定程度，達(dá)到高尿酸血癥水平時(shí)，尿酸的抗氧化能力則被氧化應(yīng)激所掩蓋，從而導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生〔4〕。而另有一些研究認(rèn)為〔5〕，心血管疾病往往伴隨尿酸排泄減少及尿酸產(chǎn)生增加的因素，像腎小球?yàn)V過(guò)率的下降、高胰島素血癥、腎血管收縮、利尿劑的使用以及組織缺血、氧化應(yīng)激等，因此認(rèn)為高尿酸是心血管疾病產(chǎn)生的結(jié)果。研究表明，高尿酸與高血壓、胰島素抵抗、肥胖、高脂血癥、糖耐量異常等因素協(xié)同作用〔6〕，加重動(dòng)脈硬化，促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型，探討尿酸是否激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑，使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)ERK1/2磷酸化，繼而誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1。

1材料與方法

1.1主要試劑尿酸,PD98059,p-ERK1/2-抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；SuperECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，中國(guó))；PAI-1 ELISA試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司，中國(guó))；HUVECs(南京凱基生物公司，中國(guó))；總蛋白提取試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1HUVECs的體外培養(yǎng)HUVECs復(fù)蘇,傳代培養(yǎng),HUVECs的計(jì)數(shù)處理，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)4個(gè)角的4個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)/ml)=4個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞/4×104×稀釋倍數(shù)。

1.2.2細(xì)胞增殖的測(cè)定接種培養(yǎng)96孔培養(yǎng)板每孔中加入細(xì)胞懸液100 μl，密度為1×105/ml置于37℃、5%二氧化碳的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將不同濃度的尿酸(119、238、476、952 μmol/L)分別加入長(zhǎng)成良好的單層細(xì)胞中，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組(蒸餾水)各6孔，使每孔最終體積為200 μl。MTT法于各孔內(nèi)加入5 mg/ml MTT液0.02 ml，再培養(yǎng)4 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.3PAI-1蛋白水平的測(cè)定將生長(zhǎng)良好的HUVES密度調(diào)整為3×104個(gè)/ml,接種于24孔培養(yǎng)板中,37℃ 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng),當(dāng)達(dá)到80%的細(xì)胞呈匯合狀態(tài),換用無(wú)血清培養(yǎng)基同步24 h。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組①不同濃度尿酸作用24 h對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中PAI-1的影響：對(duì)照組(蒸餾水)、尿酸(119、238、476、952 μmol/L)組。②尿酸476 μmol/L組作用不同時(shí)間(1、3、6、12、24 h)對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中PAI-1的影響。③PD98059對(duì)尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影響。PD98059預(yù)處理1 h后再加尿酸476 μmol/L,每組設(shè)為4個(gè)復(fù)孔,取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5ELISA檢測(cè)PAI-1蛋白含量按試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn):①試劑重建,②加樣,③洗滌,④加酶標(biāo)抗體,⑤洗滌,⑥顯色,⑦終止,⑧比色。數(shù)據(jù)處理：以A490對(duì)PAI-1標(biāo)準(zhǔn)品(ng/ml)在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)系上作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品PAI-1含量(ng/ml)可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.2.6ERK1/2磷酸化水平的影響取第三代HUVECs，按照上述方法，以2×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，用不含血清的RPMI-1640液培養(yǎng)以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的同步，24 h后去上清，并記為0時(shí)刻，按照試驗(yàn)分組，改用尿酸476 μmol/L培養(yǎng)細(xì)胞120 min，分別在0、15、30、60、120 min收集細(xì)胞樣本。

1.2.6.1蛋白含量測(cè)定①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：按說(shuō)明書(shū)配制。②檢測(cè)樣品蛋白含量。

1.2.6.2測(cè)定細(xì)胞t-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)①對(duì)齊玻璃板，夾緊，短面朝外，垂直卡在架子上。②配制10%分離膠10 ml三蒸水3.95 ml；30 % 丙烯酰胺 3.3 ml；1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 ml。③混勻。④配置5%濃縮膠5 ml；三蒸水3.4 ml；30 % 丙烯酰胺0.83 ml；1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.63 ml。⑤混勻。⑥用流水沖洗濃縮膠。⑦上樣。⑧電泳。⑨轉(zhuǎn)膜。⑩膜的封閉和抗體孵育。結(jié)果檢測(cè)：以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，并用Bandscan分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。Western印跡結(jié)束后進(jìn)行剝脫實(shí)驗(yàn)，然后用相應(yīng)的total ERK抗體進(jìn)行檢測(cè)。X-ray膜掃描。對(duì)于每個(gè)樣品，用p-ERK條帶的強(qiáng)度除以t-ERK條帶的強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1倒置顯微鏡HUVECs形態(tài)學(xué)觀察接種于96孔板，至細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁，對(duì)照組HUVECs形態(tài)為薄橢圓形、多角形或長(zhǎng)多角形,形態(tài)不一,胞質(zhì)豐富且清輪廓清晰,細(xì)胞融合成單層,貼壁生長(zhǎng),形成典型的“鋪路石樣”結(jié)構(gòu)。尿酸誘導(dǎo)后HUVECs形態(tài):尿酸(119、238 μmol/L)作用24 h細(xì)胞形態(tài)基本正常，對(duì)照組無(wú)明顯差別，隨著濃度的增加,細(xì)胞損傷程度逐漸加重，尿酸476 μmol/L作用24 h后細(xì)胞稍被拉長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，稍皺縮。尿酸952 μmol/L作用24 h后出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化,細(xì)胞明顯拉長(zhǎng)，皺縮明顯,細(xì)胞間隙增大。見(jiàn)圖1。

圖1　各組培養(yǎng)的HUVECs 24 h鏡下形態(tài)(×100)

2.2不同濃度尿酸作用HUVECs 24 h對(duì)細(xì)胞增殖影響尿酸(119、238 μmol/L)組(0.679±0.016、0.670±0.028)與對(duì)照組(0.689±0.015)相比,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響不明顯。尿酸(476、952 μmol/L)組(0.584±0.021、0.540±0.020)與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖隨濃度增加而減少(P<0.05)。

2.3不同濃度尿酸作用HUVECS 24 h對(duì)培養(yǎng)液中PAI-1蛋白的影響ELISA結(jié)果：對(duì)照組能誘導(dǎo)HUVECS分泌PAI-1(26.26±3.43)ng/ml，分別與尿酸(119、238 μmol/L)組(30.29±4.41、34.33±1.04)ng/ml比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分別與尿酸(476、952 μmol/L)組(67.83±6.35、77.4±10.36)ng/ml比較,PAI-1蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尿酸952 μmol/L組PAI-1蛋白分泌達(dá)高峰,與尿酸476 μmol/L組比較，PAI-1蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。尿酸誘導(dǎo)HUVECS分泌PAI-1蛋白的量隨濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。

2.4尿酸(476 μmol/L)組作用HUVECs不同時(shí)間對(duì)培養(yǎng)液中PAI-1蛋白的影響ELISA結(jié)果：隨尿酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PAI-1蛋白分泌量亦增加,呈時(shí)間依賴性。6、12、24 h(9.95±0.13、26.47±3.35、84.90±8.74)ng/ml分別與1 h(1.39±0.01)ng/ml PAI-1蛋白比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5尿酸對(duì)HUVECs ERK1/2磷酸化水平的影響Western印跡結(jié)果顯示，HUVECs同時(shí)表達(dá)ERK蛋白的2種亞型，即ERK1和ERK2，分子量分別為42和44 kD。對(duì)照組p-ERK1/2蛋白表達(dá)活性很低，與尿酸476 μmol/L刺激HUVECS不同時(shí)間段比較，總ERK1/2蛋白沒(méi)有變化，但p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高，尿酸作用30 min組p-ERK1/2表達(dá)條帶增強(qiáng)最明顯，與對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.6PD98059對(duì)尿酸作用HUVECS分泌PAI-1的影響ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組PAI-1蛋白表達(dá)很低(26.26±3.43)。尿酸476 μmol/L組較對(duì)照組明顯增多(67.83±6.35,P<0.05)；預(yù)先給予ERK1/2通路阻滯劑PD98059(20 μmol/L)作用后，與尿酸組476 μmol/L 比較，阻斷尿酸誘導(dǎo)的PAI-1蛋白生成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50.04±4.34,P<0.05)。

p-ERK1/2：(both bands)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶1/2 Western印跡條帶；t-ERK1/2:(total)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶1/2 Western印跡條帶 圖2　尿酸476 μmol/L作用HUVECs 不同時(shí)間對(duì)ERK1/2磷酸化水平的影響(n=3)

3討論

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明高濃度的尿酸對(duì)HUVECs有損害作用。組織型纖溶酶原激活物(t-PA) 和尿激酶纖溶酶原激活劑(u-PA)是纖溶激活系統(tǒng)的主要激活劑，使纖溶酶原變成纖溶酶，而纖溶酶的形成的調(diào)節(jié)主要通過(guò)PAI-1，PAI-1是t-PA和u-PA生理性抑制劑〔7〕。也有研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子通過(guò)ERK1/2通路誘導(dǎo)人平滑肌內(nèi)皮細(xì)胞〔8〕、鼠腎小球膜細(xì)胞〔9〕分泌PAI-1。

在冠狀動(dòng)脈循環(huán)中，t-PA和u-PA與血栓調(diào)節(jié)素結(jié)合起主要的內(nèi)源性防止血栓形成作用，因此，PAI-1的增加有可能增加冠狀動(dòng)脈血栓形成的危險(xiǎn)，有實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)數(shù)據(jù)支持PAI-1導(dǎo)致缺血性心血管疾病的發(fā)展〔10〕，在年輕的急性心肌梗死生存者中測(cè)定PAI-1明顯增加，在心梗生存者中血漿PAI-1活性亦增加，導(dǎo)致再發(fā)心肌梗死，在中年男女中，PAI-1抗原與活性增加了心梗的風(fēng)險(xiǎn)〔11〕，且獨(dú)立于其他傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素，低血漿纖溶活性反映了PAI-1活性的增加，有可能增加年輕男性患缺血性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)〔12〕。也有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持這些流行病學(xué)數(shù)據(jù)，使用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生穩(wěn)定型人類(lèi)PAI-1過(guò)表達(dá)，發(fā)展成冠狀動(dòng)脈血栓形成和心肌梗死〔13〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿酸呈時(shí)間及濃度依賴性的誘導(dǎo)HUVECs PAI-1分泌。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是尿酸的重要信號(hào)通路之一。PD98059可以有效地減弱尿酸對(duì)PAI-1蛋白合成的促進(jìn)作用，說(shuō)明ERK通路是PAI-1合成的上游調(diào)節(jié)因素，參與尿酸上調(diào)PAI-1表達(dá)的機(jī)制。本文發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路拮抗劑PD98059不能完全阻斷尿酸促進(jìn)PAI-1的合成作用，其原因可能是任何一條信號(hào)通路的作用都不是獨(dú)立的，胞內(nèi)各信號(hào)之間相互協(xié)同、相互制約的關(guān)系對(duì)完成刺激的傳遞過(guò)程十分重要。尿酸可能同時(shí)激活了細(xì)胞內(nèi)(包括P38、PI-3激酶通路等)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而各信號(hào)通路之間普遍存在的信號(hào)串話現(xiàn)象，使得尿酸的刺激作用不能完全被PD98059阻斷。

近年來(lái)尿酸與心血管疾病間的關(guān)系越來(lái)越受關(guān)注，目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是高濃度的尿酸具有致心血管疾病的作用。本研究初步證實(shí)了尿酸通過(guò)ERK1/2途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1合成，有助于更好地理解尿酸與冠心病之間的關(guān)系。

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〔2013-10-29修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)