索拉菲尼聯(lián)合紫杉醇對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用及其對(duì)cyclinD1表達(dá)水平的影響

孫煒?biāo)蜗楹捅逵氯A俞敏李玉華

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城224006)

摘要〔〕目的探討索拉菲尼(SOR)單藥、紫杉醇(PTX)單藥以及兩藥聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的抑制作用及其對(duì)周期素依賴性蛋白cyclinD1表達(dá)的影響，探討其協(xié)同作用機(jī)制。方法以不同濃度的SOR和不同濃度的PTX，分別組成單藥組和聯(lián)合用藥組，另設(shè)不加藥的對(duì)照組，作用于HepG2細(xì)胞。MTT法檢測(cè)SOR、PTX單藥及聯(lián)用后HepG2細(xì)胞的增殖抑制率，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡率；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)。結(jié)果SOR、PTX單藥與聯(lián)用均能抑制HepG2細(xì)胞增殖，且呈明顯時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，兩藥聯(lián)用有協(xié)同效應(yīng)，可使HepG2細(xì)胞增殖率明顯下降，細(xì)胞數(shù)減少，聯(lián)合組與對(duì)應(yīng)的單藥組間差異顯著(P<0.05)；藥物作用48 h后，給藥組cyclinD1 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，兩藥聯(lián)用cyclinD1表達(dá)更顯著，與單藥組比較有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論SOR和PTX聯(lián)用可協(xié)同下調(diào)HepG2細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)，增強(qiáng)了抑制HepG2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡效應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕索拉菲尼；紫杉醇；cyclinD1；肝癌

中圖分類號(hào)〔〕R735.7〔

基金項(xiàng)目：鹽城市科技局科研項(xiàng)目(YK20113109)

通訊作者：李玉華(1963-)，男，教授，主要從事腫瘤分子機(jī)制研究。

第一作者：孫煒(1964-)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事免疫分子機(jī)制研究。

原發(fā)性肝癌(PHC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高、容易侵襲轉(zhuǎn)移，死亡率高。因此，尋找一種合理有效的治療方案具有重要的意義〔1〕。索拉非尼(SOR)是一種多激酶抑制劑，作為第1個(gè)在肝癌治療中獲得優(yōu)勢(shì)生存的靶向藥物〔2〕，已被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)確定用于肝癌患者的治療。紫杉醇(PTX)是十分有效的抗腫瘤藥，主要機(jī)制為該藥能通過(guò)與微管蛋白相結(jié)合，阻止微管解聚，穩(wěn)定已組裝好的微管的結(jié)構(gòu)和促進(jìn)微管組裝，致微管組裝和平衡打亂。因此在組裝過(guò)程中，紫杉醇的敏感性與周期蛋白依賴激酶(CDK)及其調(diào)節(jié)因子cyclinD1水平有關(guān)〔3，4〕。本研究探討SOR聯(lián)合PTX對(duì)人肝癌 HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑索拉菲尼(SOR，德國(guó)拜耳公司)；用100%二甲基亞砜(DMSO，南京賽泓瑞生物科技有限公司)溶解，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋，DMSO終濃度<0.5%。紫杉醇(PTX，江蘇楊子江制藥有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó) Sigma 公司)，用pH7.35 PBS配制成濃度為5 mg/ml。碘化丙啶(PI)試劑盒購(gòu)自Sigma公司。人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在37.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%新生牛血清的RPMI 1640，含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法測(cè)定SOR、PTX單藥組、SOR和PTX聯(lián)合組對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率試驗(yàn)分組：無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照組；SOR組：20、12、6、3 μmol/L；PTX：30、20、10、5 μg/ml；聯(lián)合組：SOR20 μmol/L+PTX30 μg/ml、SOR12 mol/L+PTX20 μg/ml、SOR6 mol/L+PTX10 μg/ml、SOR3 mol/L+PTX5 μg/ml，共分13組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以7×103/孔密度接種于96孔板，每種濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔加200 μl，對(duì)照組加同量培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。加藥后培養(yǎng)48 h，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去原培養(yǎng)液，離心將其紫色結(jié)晶沉淀于培養(yǎng)板底部，去上清。加入DMS0 150 μl/孔，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)定每個(gè)孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分組同MTT法，加藥24 h后分別收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期及凋亡率檢測(cè)。細(xì)胞周期檢測(cè)：0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min 用8 ml PBS 制備單細(xì)胞懸液，加2 ml 75%預(yù)冷乙醇，吹打均勻，置4℃固定過(guò)夜，次日4℃3 000 r /min離心5 min，吸棄乙醇，用PBS重懸2次，加入PI染液500 L，4℃避光孵育20 min，上機(jī)檢測(cè)，所得結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析；凋亡率檢測(cè)：調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，加入Annexin V-EGFP 5 L和5 L PI，避光室溫反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.5RT-PCR檢測(cè)CyclinD1 mRNA取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞試驗(yàn)分組：無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照組；SOR(20 μmol/L)及PTX(30 μmol/L)單藥組；SOR+ PTX聯(lián)合組。0.25%的胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，用含10%的小牛血清，100 U ml青霉素和100 U ml 鏈霉素的 RMIP 1640 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/ml密度接種5 ml于培養(yǎng)瓶中，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)；藥物處理：24 h細(xì)胞貼壁后換 RMIP1640 培養(yǎng)液，加入500 L藥物，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞總RNA提取(TRIzol法)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)并鑒定總RNA濃度和純度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)如下：上游引物：5'- GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA -3'，下游引物：5'- GCTGGAAACATGCCGGTTA -3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度218 bp；β-actin內(nèi)參照：上游引物： 5'- CTCGCGCTACTCTCTCTTTC -3'，下游引物 5'- CAGTCTCGATCC- CACTTAA -3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度330 bp，退火溫度：58℃，分別取10 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V電壓)，紫外燈下觀察電泳帶，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照，將凝膠電泳圖像輸入美國(guó)Alpha9900凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用1-D Image Analysis Software進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同處理組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用MTT法結(jié)果顯示，SOR和PTX單藥組、聯(lián)合組能明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈明顯量效關(guān)系。隨給藥濃度的提高，抑制率逐漸升高，隨著藥物濃度的增大,其對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，SOR和PTX單藥組間無(wú)顯著差別(P>0.05)，聯(lián)合組與對(duì)應(yīng)的單藥組間差別顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組細(xì)胞凋亡率SOR和PTX單藥組及聯(lián)合用藥組與對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.05)；聯(lián)合組凋亡率最高，與SOR和PTX單藥組比較具有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3RT-PCR檢測(cè)不同組HepG2細(xì)胞中cyclinD1 mRNA的表達(dá)見(jiàn)圖1。對(duì)照組，SOR組，PTX組和聯(lián)合組中cyclinD1/β-actin mRNA的比值依次為(89.00±1.03)，(56.14±1.20)，(52.03±0.87)和(28.42±0.13)，SOR和PTX單藥組、聯(lián)合組與對(duì)照組及單藥組與聯(lián)合組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

表1　不同藥物濃度組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖

與相應(yīng)濃度單藥組比較：1)P<0.05

1～4：對(duì)照組、SOR組、PTX組及聯(lián)合組 圖1　不同藥物組HepG2細(xì)胞中cyclinD1 mRNA表達(dá)

3討論

cyclinD1是CDK激酶的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)化過(guò)程中作為正性調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞周期G1期細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白，cyclinD1作為G1期細(xì)胞周期素，通過(guò)對(duì)抑癌基因蛋白pRb的調(diào)控促使細(xì)胞越過(guò)G1/S限制點(diǎn)進(jìn)入S期，cyclinD1于G1初期開(kāi)始累積，于DNA合成前達(dá)峰值，S期含量最低。已證實(shí)其過(guò)度表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的旺盛分裂有關(guān)，是被公認(rèn)的原癌基因〔5〕。研究已發(fā)現(xiàn)該基因可在多種腫瘤中發(fā)生突變，擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，cyclinD1過(guò)表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類型、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)cyclinD1的腫瘤患者預(yù)后較差〔6，7〕，其機(jī)制可能為腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)cyclinD1，導(dǎo)致細(xì)胞G1期縮短，提前進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期縮短，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)，加速腫瘤的生長(zhǎng)。

SOR是一種新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物〔8，9〕，能夠抑制MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，Raf激酶在大部分肝細(xì)胞癌中過(guò)度表達(dá)，并且Raf/ MEK/ERK 通路能被 HBV 、HCV 感染和有絲分裂生長(zhǎng)因子所激活。Liu等〔10〕亦證實(shí)了SOR 能夠抑制 PLC/PRF/5 和 HepG2 肝癌細(xì)胞株的Raf激酶活性，進(jìn)而阻斷MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并可降低細(xì)胞株的cyclinD1水平，從而抑制癌細(xì)胞增殖。此外，SOR也能通過(guò)抑制 Raf/MEK/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路降低elF4E的磷酸化水平下調(diào)bcl-2家族成員的抗凋亡蛋白MCL-1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡。

PTX誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制不十分清楚，主要為PTX擾亂真核細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微管系統(tǒng)。耿長(zhǎng)新等〔11〕認(rèn)為微管蛋白是PTX抗癌作用的靶點(diǎn)，微管在細(xì)胞分裂過(guò)程中形成紡錘體，對(duì)細(xì)胞的有絲分裂起重要作用。PTX選擇性地與微管蛋白亞基N -末端第31位氨基酸結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白聚合成穩(wěn)定的微管并且抑制微管解聚，破壞微管系統(tǒng)的正常平衡，擾亂細(xì)胞有絲分裂間期細(xì)胞形態(tài)、活動(dòng)性、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的阻滯，將增殖期的腫瘤細(xì)胞阻滯在G2-M期〔12〕；Chu等〔13〕的研究表明，PTX通過(guò)磷酸化抑制凋亡的bcl-2原癌基因，使其原本抑制凋亡的作用下降，破壞了促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡；另有研究結(jié)果：PTX通過(guò)抑制硫氧還蛋白，低氧誘導(dǎo)因子-1α以及cyclinDl的表達(dá)降低HepG2的活性，抑制其生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡〔14〕。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SOR和PTX聯(lián)用明顯增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的抑制率和促進(jìn)其凋亡的作用，RT-PCR檢測(cè)兩藥聯(lián)用后HepG2細(xì)胞中cyclinD1 mRNA明顯下調(diào)。因此，兩藥聯(lián)用協(xié)同作用機(jī)制可能如下：①可能協(xié)同作用抑制HepG2細(xì)胞中cyclinD1 mRNA表達(dá)，下調(diào)cyclinD1蛋白表達(dá)的信號(hào)通路，抑制cyclinD1蛋白的合成，阻滯細(xì)胞從G1期向S期分化〔5〕。②PTX促進(jìn)微管蛋白聚合成穩(wěn)定的微管并且抑制微管解聚，破壞微管系統(tǒng)的正常平衡，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的阻滯，將增殖期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步阻滯在G2-M期。③已有研究證實(shí)：PTX的耐藥機(jī)制可能與抗凋亡蛋白bcl-2及bcl-XL的過(guò)度表達(dá)存在密切關(guān)系，它們能通過(guò)抑制線粒體凋亡通路最終阻斷紫杉醇所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔15〕。而SOR可以下調(diào)bcl-2家族成員的抗凋亡蛋白MCL-1的表達(dá)〔16〕，因此聯(lián)用可能對(duì)拮抗PTX產(chǎn)生耐藥性有一定的意義，這還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

作為一種新的靶向性藥物，SOR與化療藥物聯(lián)用的多項(xiàng)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)已在不同的實(shí)體腫瘤中展開(kāi)〔17～19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示顯示：SOR和PTX聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用要大于單藥治療的效果。但要為臨床應(yīng)用提供更為確切的理論依據(jù)，SOR聯(lián)用化療藥物治療腫瘤的最佳方案仍需進(jìn)行臨床前的大量研究。

4參考文獻(xiàn)

1Wu J,Luo RC,Zhang H,etal.Inhibitory effect of sorafenib combined with arsenic trioxide on hepatocellular carcinoma cells〔J〕.J South Med Univers,2008；28(4):639-45.

2Josep M，Llovet MD,Sergio Ricci MD,etal.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma〔J〕.N Engl J Med,2008；359(4):378-90.

3Nakayama S,Torikoshi Y,Takahashi T,etal.Prediction of paclitaxel sensitivity by CDK1 and CDK2 activity in human breast cancer cells〔J〕.Breast Cancer Res,2009；11(1):R12.

4Takahashi T,Yamasaki F,Sudo T,etal.CyclinA-associated kinase activity is needed for paclitaxel sensitivity〔J〕.Mol Cancer Ther,2005;4(7):248-56.

5Frolov MV,Dyson NJ.Molecular mechanisms of E2F-dependent activation and pRB-mediated repression〔J〕.J Cell Sci,2004；117(Pt 11):2173-81.

6Udhayakumar G，Jayanthi V，Devaraj N,etal.Interaction of MUC1 with beta-catenin modulates the Wnt target gene cyclinD1 in H.pylori-induced gastric cancer〔J〕.Mol Carcinog,2007；46(9):807-17.

7Fu ZJ,Ma ZY,Wang QR,etal.Overexpression of CyclinD1 and underexpression of p16 correlate with lymph node metastases in laryngeal squamous cell carcinoma in Chinese patients〔J〕.Clin Exp Metastasis，2008；25(8):887-92.

8Bellmunt J,Eisen T,Fishman M,etal.Experience with sorafenib and adverse event management〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2011；78(1):24-32.

9Richly H,Schultheis B,Adamietz IA,etal.Combination of sorafenib and doxorubicin in patients with advanced hepatocellular carcinoma:results from a phase I extension trial〔J〕.Eur J Cancer，2009；45(4):579-87.

10Liu L,Cao Y,Ellen C,etal.Sorafenib blocks theRAF/MEK/ERK pathway,inhibits tumor angiogenesis,and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF〔J〕.Cancer Res,2006；66(24):11851-8.

11耿長(zhǎng)新，曾昭沖，周長(zhǎng)宏，等.多烯紫杉醇體內(nèi)對(duì)肝癌入化療及其對(duì)p21和bcl-2表達(dá)影響〔J〕.世界華人消化雜志，2005；13(24)：2848-52.

12Wu HG,Bang YJ,Choi EK,etal.Phase I study of weekly docetaxel and cisplatin concurrent with thoracic radiotherapy in Stage Ⅲ non-small-cell lung cancer〔J〕.Int Radiat Oncol Biol Phys,2002；52(2):75-80.

13Chu JJ,Liu JM,Tsou MH,etal.Effects of paclitaxel and doxorubicin in histocultures of hepatocellular carcinomas〔J〕.Biomed Sci,2007；14(2):233-44.

14張寧,白潔.紫杉醇抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)理研究〔D〕.昆明理工大學(xué)，2012：20.

15Huang Y,Ibrado AM,Reed JC,etal.Co-expression of several molecular mechanisms of multidrug resistance and their significance for paclitaxel cytotoxicity in human AML HL-60 cells〔J〕.Leukemia,1997；11(2):253-7.

16Zhu H,Barber R,Shaw GM,etal.Is Sonic hedgehog(SHH)a candidate gene for spina bifida? A pilot study〔J〕.Am J Med Genet A,2003；117A(1):87-8.

17Jordi Bruixl,Jean-Luc Raoul,Morris Sherman,etal.Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma:subanalysis of a phase Ⅲ trial〔J〕.J Hepatol，2012；57(4):821-9.

18Giovan Giuseppe Di Costanzo,Raffaella Tortora,Luca Iodice,etal.Safety and effectiveness of sorafenib in patients with hepatocellular carcinoma in clinical practice〔J〕.Dige Liver Dis，2012；44(9):788-92.

19Zhang X,Yang XR,Huang XW,etal.Sorafenib in treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma:a systematic review〔J〕.Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2012；11(5):458-66.

〔2013-10-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)