α-硫辛酸對(duì)大鼠急性胰腺炎相關(guān)腎損傷的保護(hù)作用

趙麗梅馮志杰高軍萍孫澤明宋梅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討α-硫辛酸(ALA)對(duì)急性胰腺炎(AP)大鼠腎臟細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1與血管細(xì)胞間黏附分子(VCAM)-1表達(dá)水平的影響及其在氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用3.5%?；悄懰徕c逆行胰膽管注射制備AP大鼠模型，將雄性Wistar大鼠72只。隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(SO組,n=24)、AP組(n=24)、ALA治療組(ALA組,n=24)，于造模后腹腔內(nèi)注射ALA(1 mg/kg)，各組以不同時(shí)間點(diǎn)3 h、6 h、12 h分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組為8只大鼠。采用生化法測(cè)定血清的淀粉酶及腎功能肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)水平；硫代巴比妥酸法檢測(cè)腎組織勻漿中丙二醛(MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活力；應(yīng)用HE染色觀察腎臟組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)(SP)法檢測(cè)腎組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果在AP組各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶、Cr、BUN及腎組織中MDA含量均較SO組顯著升高，而腎組織的SOD活力則明顯降低，光鏡下HE染色可見腎近曲小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎小球淤血，腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化法染色后觀察在SO組腎組織中幾乎沒有ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)，而在AP組中則有較強(qiáng)的表達(dá)。與AP組相比，在ALA組血清淀粉酶、Cr、BUN及腎組織MDA含量較AP模型組明顯降低，SOD活力則明顯升高，給予ALA治療后組織損傷明顯改善，僅有腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)已不明顯，ICAM-1與VCAM-1表達(dá)明顯減弱。結(jié)論AP大鼠存在腎臟氧化應(yīng)激損傷和腎臟炎性細(xì)胞因子的激活，ALA可以通過(guò)其抗氧化作用以及抑制炎性細(xì)胞因子ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)對(duì)大鼠AP相關(guān)腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕α-硫辛酸；急性胰腺炎；腎損傷

中圖分類號(hào)〔〕R576〔

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃基金(No.20110089)

通訊作者：馮志杰(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)科疾病研究。

第一作者：趙麗梅(1976-)，女，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要從事消化內(nèi)科疾病研究。

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥之一，近年來(lái)發(fā)病率明顯增多，盡管大部分的胰腺炎表現(xiàn)為輕度，但據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)約22.5%的病人會(huì)發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，繼之發(fā)展為多器官障礙綜合征(MODS)，成為重癥急性胰腺炎(SAP)，其病情兇險(xiǎn)，并發(fā)癥涉及全身各臟器〔1〕。研究顯示SAP伴急性腎損傷(AKI)病人發(fā)生MODS的概率很高(88.1%)而且發(fā)展至急性腎衰竭(ARF)后病死率高達(dá)80%，出現(xiàn)ARF后其他臟器衰竭發(fā)生率也明顯上升〔2，3〕，因此，早期預(yù)防、治療AP患者的腎損傷具有重要臨床意義。圍繞AP相關(guān)腎損傷的機(jī)制有著眾多的研究，其中炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子以及氧自由基的作用是目前研究的熱點(diǎn)。本文通過(guò)建立AP腎損傷的模型并給予抗氧化劑α-硫辛酸(ALA)作為治療，通過(guò)檢測(cè)腎功能、腎臟病理學(xué)，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子-1(VCAM-1)在腎組織中的蛋白表達(dá)及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化應(yīng)激指標(biāo)，以探討ALA對(duì)AP相關(guān)腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72只清潔級(jí)成年健康雄性Wistar大鼠，體重(250±25)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。全部動(dòng)物均在同一實(shí)驗(yàn)室按清潔級(jí)大鼠要求專人飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合中華人民共和國(guó)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.2主要試劑MDA及SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；多克隆兔抗ICAM-1抗體、多克隆兔抗VCAM-1抗體、免疫組織化學(xué)SP試劑盒以及DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司；?；悄懰徕c與ALA均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3動(dòng)物模型建立采用3.5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/kg逆行胰膽管注射建立雄性SD大鼠AP模型。具體操作方法如下：選取清潔健康雄性Wistar大鼠，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，標(biāo)記，隨機(jī)分組。大鼠實(shí)驗(yàn)前24 h開始禁食，自由飲水。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，取仰臥位，將動(dòng)物四肢及頭固定于操作臺(tái)上，備皮、消毒、鋪無(wú)菌洞巾，于上腹正中作2 cm切口進(jìn)入腹腔，顯露胰膽管，在近肝門處用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉胰膽管后，用4號(hào)加工鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2 ml/min速度注入3.5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g)，推藥后用無(wú)創(chuàng)血管夾夾住胰膽管入十二指腸處，觀察10 min，去除血管夾，關(guān)腹，經(jīng)胰腺病理學(xué)證實(shí)AP造模成功。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將72只大鼠隨機(jī)分成3組，每組24只，各組又隨機(jī)分為3、6、12 h時(shí)間點(diǎn)3個(gè)亞組，每亞組為8只大鼠。①假手術(shù)組(SO組)：開腹翻動(dòng)十二指腸并觸摸胰腺3次。②AP組：制造AP模型組。③ALA組：制造AP模型成功后，于腹腔內(nèi)注射ALA(1 mg/kg)。

1.5取材分別于3 h、6 h、12 h處死各組大鼠取材，下腔靜脈穿刺抽取全血2 ml用于測(cè)定血淀粉酶、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等生化指標(biāo)；取胰腺組織及楔形腎組織塊，一部分以10%甲醛固定，用于HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另一部分用PBS液浸潤(rùn)(1∶9)后，用組織勻漿器冰浴下制成組織勻漿，4℃離心2 000 r/min 30 min，取上清液-70°保存，進(jìn)行腎組織SOD、MDA及蛋白定量檢測(cè)。胰腺組織只作光鏡檢查，證實(shí)AP制模成功。

1.6檢測(cè)指標(biāo)①腎組織MDA及SOD含量測(cè)定：用硫代巴比妥酸分光光度比色法測(cè)定腎組織MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量，按照說(shuō)明書操作方法測(cè)定。②胰腺及腎組織HE染色：常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，行HE常規(guī)染色，光鏡下觀察胰腺和腎臟組織病理變化。③免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎組織中ICAM-1及VCAM-1表達(dá)：按照SP試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化，檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，涼至室溫，經(jīng)3% H2O2常溫孵育15min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，再加入一抗ICAM-1抗體(PBS稀釋成1∶100)，4℃冰箱過(guò)夜，再分別加二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗為標(biāo)準(zhǔn)。每例標(biāo)本鏡下400倍隨機(jī)選取10個(gè)視野，采集圖像，應(yīng)用 Image pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量，以陽(yáng)性細(xì)胞染色的平均光密度值(OD值)來(lái)表示抗原的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清淀粉酶的變化在3、6和12 h各時(shí)間點(diǎn)，SO組無(wú)明顯變化。與SO組比較，在AP組和ALA組均顯著升高(P<0.01)，且隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，血清淀粉酶逐漸升高。而ALA組較AP比較血清淀粉酶則明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1　AP大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN水平以及腎組織SOD活力、MDA含量測(cè)定

與SO組比較：1)P<0.05，與AP組比較：2)P<0.05，與同組3 h比較：3)P<0.05，與同組6 h比較：4)P<0.05

2.2各組大鼠腎功能的變化血清Cr與BUN在3、6和12 h各時(shí)間點(diǎn)，SO組無(wú)明顯變化。與SO組比較，急AP組和ALA組均顯著升高(P<0.01)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)Cr、BUN升高更為明顯。與AP組比較，ALA組血清Cr、BUN水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3腎組織MDA、SOD含量的變化與SO組相比，AP組大鼠腎臟的脂質(zhì)過(guò)氧化程度增高；在6 h和12 h AP組腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平明顯高于SO組(P<0.01)；SOD活力則明顯低于SO組(P<0.01)；而在3 h時(shí)腎組織中各組之間MDA與SOD無(wú)差異(P>0.05)；給予ALA治療后大鼠腎臟的脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA較同時(shí)段AP組降低(P<0.05)，SOD增加，(P<0.05)。見表1。

2.4鏡下腎臟組織病理學(xué)變化SO組大鼠腎皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，腎小球和腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)均正常，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差別；AP組術(shù)后3 h腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，腎間質(zhì)可見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；6 h腎小球可見輕度淤血，腎小管上皮細(xì)胞呈明顯水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染，腎間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟組織損傷逐漸加重，腎近曲小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎小球淤血，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而ALA組僅少數(shù)上皮細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞界限不清，胞質(zhì)內(nèi)有淡粉紅色顆粒。見圖1。

2.5腎組織ICAM-1與VCAM-1蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)ICAM-1與VCAM-1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色染色，高倍鏡下觀察呈細(xì)顆粒狀。見圖2，圖3。在SO組，腎組織中

SO組6 h　　　　　AP組6 h　　　　ALA治療組12 h 圖1　AP大鼠腎組織的病理學(xué)變化(HE，×200)

AP組3 h　　　　　　AP組12 h　　　　ALA治療組12 h 圖2　AP大鼠腎組織的ICAM-1表達(dá)(DAB,×400)

AP組6 h　　　　　　AP組12 h　　　　ALA治療組 圖3　AP大鼠腎組織的VCAM-1表達(dá)(SP,×400)

幾乎沒有ICAM-1、VCAM-1表達(dá)。AP組大鼠術(shù)后3 h ICAM-1已可見少量表達(dá)(OD值：SO組vs AP組0.07±0.00 vs 0.08±0.02)，但與SO組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。隨著時(shí)間的推移，AP組6 h與12 h檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ICAM-1表達(dá)均明顯增加，與SO組相比其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(SO組vs AP組0.05±0.00 vs 0.17±0.01；0.05±0.01 vs 0.24±0.03)(P<0.01)；ALA組同樣在3、6、12 h均可見到ICAM-1的表達(dá)，但與AP組相比，表達(dá)為明顯減弱(P<0.05)。VCAM-1的表達(dá)則出現(xiàn)在AP組與ALA組的6 h與12 h，且在12 h有明顯表達(dá)，與SO組相比有顯著差異(P<0.01)；與AP組相比，ALA組VCAM-1的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，兩組之間有顯著差異(P<0.05)。

3討論

AP發(fā)生后機(jī)體發(fā)生了一系列的病理變化，其中SIRS、氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素血癥、微循環(huán)障礙導(dǎo)致全身及腎血流動(dòng)力學(xué)改變等均對(duì)腎臟功能產(chǎn)生一定的影響〔4〕。AP時(shí)胰腺組織缺血，局部微循環(huán)紊亂，毛細(xì)血管損傷所致的胰腺血管通透性增加，缺血組織中的吞噬細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞聚集后產(chǎn)生大量的氧自由基(OFR)并激發(fā)自由基的連鎖增殖反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)MDA含量升高，而SOD活性降低，過(guò)多的自由基可直接損傷腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，最終腎小球?yàn)V過(guò)率下降導(dǎo)致急性腎衰竭〔5〕；同時(shí)氧自由基還可激活核因子-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，造成細(xì)胞因子、黏附分子等過(guò)度表達(dá)〔6〕。從而介導(dǎo)胰腺和胰外器官血管內(nèi)皮損傷、微循環(huán)障礙和血管通透性增加，引起胰腺和全身器官的功能損傷。研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)腎功能損害僅次于肺損傷，且與胰腺炎的預(yù)后密切相關(guān)〔7〕。Telek等〔8〕研究顯示SAP腎損傷時(shí)腎組織的SOD和MDA與SAP腎損傷呈正相關(guān)，因此認(rèn)為OFR引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是SAP腎損傷重要因素。ICAM-1及VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，通過(guò)識(shí)別其受體白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)與白細(xì)胞表面配體VLA-4等可促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及滲出，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，造成血管病變，導(dǎo)致組織器官發(fā)生病理生理改變而促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)。病理情況下，它們可在病變的腎小管上皮細(xì)胞上強(qiáng)烈表達(dá)，為腎臟炎癥活動(dòng)的主要標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1及VCAM-1是誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向腎間質(zhì)組織浸潤(rùn)的主要黏附分子〔9～11〕。黏附分子在腎臟免疫性炎性損傷時(shí)，介導(dǎo)了單核/巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞在血管壁的黏附，繼而穿過(guò)血管壁向炎癥區(qū)域移行、聚集，導(dǎo)致和促進(jìn)組織損傷。炎性細(xì)胞在腎組織的持續(xù)浸潤(rùn)是腎臟炎癥反應(yīng)擴(kuò)大和腎功能損害的重要因素，這些炎癥因子在急性腎損傷時(shí)明顯增加,同時(shí)加重對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞損傷作用〔12，13〕。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，病理情況下，ICAM-1可在病變的腎小管上皮細(xì)胞上強(qiáng)烈表達(dá)，為腎臟炎癥活動(dòng)的主要標(biāo)志。腎缺血/再灌注損傷時(shí)，ICAM-1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致循環(huán)白細(xì)胞在局部黏附，使內(nèi)皮通透性增加，且浸潤(rùn)、激活的白細(xì)胞還可導(dǎo)致直接的組織損傷，ICAM-1缺陷大鼠能朋顯減輕腎缺血/再灌注損傷，因此拮抗ICAM-1可減輕腎損傷〔14，15〕?？傊贏P時(shí)，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相互影響，參與細(xì)胞損傷過(guò)程，致炎因子和氧化應(yīng)激發(fā)揮協(xié)同作用，觸發(fā)共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致炎癥的級(jí)聯(lián)放大，從而導(dǎo)致腎臟功能的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模組大鼠可見一般狀況的改變，血肌酐、尿素氮明顯升高，MDA增高和SOD下降，免疫組化結(jié)果顯示ICAM-1與VCAM-1在AP造模組和治療組表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明這兩種黏附分子可能在氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)狀態(tài)下被激活，進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)贏P腎損傷發(fā)展過(guò)程中的作用，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道相符。

ALA為一種新型抗氧化劑，是類維生素物質(zhì)，有很強(qiáng)抗氧化活性，和其還原態(tài)二氫硫辛酸(DHLA)一起被譽(yù)為“萬(wàn)能抗氧化劑”，是氧化應(yīng)激的強(qiáng)效抑制劑，在臨床可以用于預(yù)防和治療多種疾病。在癌癥、衰老、糖尿病(DM)、動(dòng)脈粥樣硬化、腦和神經(jīng)組織的退化性等疾病中發(fā)揮著重要的作用，已受到國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。它兼有脂溶性與水溶性有特性，能被消化道輕易吸收，可以分布到機(jī)體的各個(gè)部位發(fā)揮作用。主要作用：①可以直接清除ROS；②螫合金屬離子，降低DH的產(chǎn)生，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化；③再生(還原)其他的抗氧化劑〔16～21〕。Aitken等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可以通過(guò)調(diào)控GPx、硫氧蛋白還原酶等的活力來(lái)抵制ICAM-1與VCAM-1在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)，從而緩解了炎癥反應(yīng)，減低了疾病的發(fā)生率與嚴(yán)重程度。代新華等〔23〕的研究則表明ALA能顯著降低DM大鼠氧化應(yīng)激水平，減輕氧化應(yīng)激對(duì)腎組織的損傷及炎癥反應(yīng)而保護(hù)腎臟。

本實(shí)驗(yàn)表明ALA對(duì)AP相關(guān)性腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化作用和抑制腎組織中ICAM-1與VCAM-1的釋放有關(guān)。

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〔2013-08-22修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)