人乳頭狀瘤病毒感染、P53及缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性

周穎張輝謝永紅1趙敏沈彥

(秦皇島市第一醫(yī)院病理科，河北秦皇島066000)

摘要〔〕目的探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生中的病因?qū)W意義，分析HPV感染與P53和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)60例NSCLC及20例肺良性病變組織中P53、HIF-1α蛋白的表達(dá)，應(yīng)用PCR方法選用HPV16、18型特異性引物檢測(cè)兩組中HPV DNA的表達(dá)。結(jié)果①HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%，肺良性病變組5.0%，二者有顯著差異(P<0.05)。②NSCLC中P53和HIF-1α的表達(dá)陽(yáng)性率分別為43.3%和48.3%，肺良性病變組均未見陽(yáng)性表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③NSCLC中P53的表達(dá)率與HIF-1α呈正相關(guān)(r=0.500，P<0.05)。④HPV DNA陽(yáng)性組中P53的表達(dá)率為60.0%高于HPV DNA陰性組31.4%(P<0.05)。HPV DNA陽(yáng)性組與陰性組間HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.0%和45.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一，HPV感染降解野生型P53蛋白，誘導(dǎo)P53基因突變，從而促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞〔〕非小細(xì)胞肺癌；人乳頭狀瘤病毒；P53蛋白；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

中圖分類號(hào)〔〕R734.2〔

基金項(xiàng)目：秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012023A135)

1秦皇島市第一醫(yī)院科教科

第一作者：周穎(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種DNA病毒，感染人和動(dòng)物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外臨床和實(shí)驗(yàn)室研究檢測(cè)出肺癌患者攜帶HPV〔1，2〕，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染與肺癌的關(guān)系，目前說(shuō)法不一。P53為人類最常見的抑癌基因之一，在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)。腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)所造成的缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，而HIF-1α又可調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)而促進(jìn)血管的形成和腫瘤的生長(zhǎng)。然而肺癌中P53、HIF-1α與HPV感染的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中HPV DNA、P53和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，探討HPV感染在NSCLC發(fā)生中的病因?qū)W意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集秦皇島市第一醫(yī)院2012年1～5月NSCLC新鮮標(biāo)本60例，男46例，女14例；年齡36～80歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；吸煙者43例，不吸煙者17例。20例肺良性病變組織，其中包括肺結(jié)核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴(kuò)張1例。標(biāo)本取材后，部分置-20℃保存，部分中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。

1.2HPV PCR檢測(cè)

1.2.1引物選用分別用來(lái)擴(kuò)增HPV16、18型的特異性引物2對(duì)。引物均由北京奧科生物公司合成。引物序列如表1。

表1　引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.2組織DNA的提取取適量?jī)龃娼M織，加提取緩沖液制成單細(xì)胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復(fù)抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無(wú)水乙醇沉淀、70%冰冷無(wú)水乙醇洗滌后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)緩沖液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系：每25 μl反應(yīng)體系中包含 10倍緩沖液2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去離子水16.5 μl及DNA模板2 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)特征為94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。每次實(shí)驗(yàn)以不加模板為陰性對(duì)照，HPV16、18型分別用Siha和Hela細(xì)胞株DNA作陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用加有溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.3P53、HIF-1α免疫組化檢測(cè)

1.3.1試劑與方法P53抗體、HIF-1α抗體及通用型SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，染色步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3.2判斷標(biāo)準(zhǔn)HIF-1α和P53陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用半定量評(píng)分系統(tǒng)獨(dú)立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果：0分陰性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽(yáng)性強(qiáng)度：1分弱表達(dá)(淺黃色)；2分中等強(qiáng)度表達(dá)(棕黃色)；3分強(qiáng)表達(dá)(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(±)，4～6分為中等陽(yáng)性(+)，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性()。就其結(jié)果進(jìn)行分析，將-、±合并為“-”，+、合并為“+”，以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1HPV DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果及其與臨床病理特征的關(guān)系HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%(25/60)，肺良性病變組5.0%(1/20)，二者有顯著差異(χ2=9.193，P<0.05)(圖1)；HPV16、18型特異性引物分型檢測(cè)，HPV16檢出率為48.0%(12/25)，HPV 18檢出率為52.0%(13/25)。NSCLC組HPV感染與性別、年齡、組織學(xué)分型、吸煙無(wú)關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表2。

M：Marker；1、2：HPV16 陽(yáng)性、陰性對(duì)照；3、4：HPV16；5、6：HPV18 陽(yáng)性、陰性對(duì)照；7、8：HPV18 圖1　PCR檢測(cè)HPV16、18型DNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

臨床病理特征nHPV感染χ2值P值P53χ2值P值HIF-1αχ2值P值性別 男4619(41.3)0.0110.91820(43.5)0.0020.96721(45.7)0.5680.451 女146(42.9)6(42.9)8(57.1)年齡(歲) <60156(40.0)0.0230.8806(40.0)0.0900.7647(46.7)0.0220.881 ≥604519(42.2)20(44.4)22(48.9)吸煙史 吸煙4318(41.9)0.0020.96121(48.8)1.8720.17123(53.5)1.6150.204 不吸煙177(41.2)5(29.4)6(35.3)組織學(xué)分型 鱗癌4218(42.9)0.0820.77521(50.0)2.5340.11118(42.9)1.6810.195 腺癌187(38.9)5(27.8)11(61.1)分化程度 高分化121(8.3)6.8570.0093(25.0)2.0530.1522(16.7)6.0230.014 中、低分化4824(50.0)23(47.9)27(56.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有3018(60.0)8.2970.00415(50.0)1.0860.29720(66.7)8.0760.004 無(wú)307(23.3)11(36.7)9(30.0)

2.2P53、HIF-1α的檢測(cè)結(jié)果及兩者的相關(guān)性NSCLC中P53的陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核(圖2)，陽(yáng)性率為43.3%(26/60)，肺良性病變組未見陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.840，P<0.05)。HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)也位于細(xì)胞核(圖2)，陽(yáng)性率為48.3%(29/60)，肺良性病變組未見陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.163，P<0.05)。P53陽(yáng)性組中HIF-1α的表達(dá)率76.9%(20/26)，明顯高于P53陰性組26.5%(9/34)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者呈正相關(guān)(r=0.500，P<0.05)。

2.3P53、HIF-1α蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系NSCLC組中P53表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05)。HIF-1α表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，見表2。

P53

HIF-1α

2.4HPV感染與P53、HIF-1α表達(dá)的關(guān)系HPV DNA陽(yáng)性組中P53的表達(dá)率為60.0%(15/25)高于HPV DNA陰性組31.4%(11/35)(P<0.05)。HPV DNA陽(yáng)性組與陰性組間HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.0%(13/25)和45.7%(16/35)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來(lái)HPV感染與肺癌的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視〔3〕。本研究提示HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一。HPV感染與NSCLC患者臨床病理資料的關(guān)系目前尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型NSCLC HPV DNA的檢出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的細(xì)胞退出了細(xì)胞周期，細(xì)胞不再具有分裂能力，細(xì)胞內(nèi)僅有少量病毒復(fù)制所需的復(fù)制酶。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV DNA的檢出率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Lane等〔4〕報(bào)道HPV陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞株與HPV陰性的相比VEGF的表達(dá)水平普遍升高。Lopezocejo等〔5〕認(rèn)為HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠使VEGF表達(dá)增強(qiáng)。VEGF不僅誘導(dǎo)血管生成，還可誘導(dǎo)腫瘤外周形成新的淋巴管，促進(jìn)癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。由此推測(cè)HPV感染與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能存在一定的相關(guān)性。

抑癌基因P53是惡性腫瘤中突變率最高的基因。野生型P53半衰期短，不易被檢測(cè)到，突變型P53半衰期長(zhǎng)達(dá)7 h，在細(xì)胞內(nèi)堆積易被檢測(cè)到，但失去了對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)作用，因而促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增生和癌變，容易通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)。故本研究中采用免疫組化法所測(cè)得的均屬于突變型P53蛋白〔6〕。有研究顯示HPV16、18型E6可以降解野生型P53蛋白，導(dǎo)致上皮細(xì)胞的增殖分化失控，引起腫瘤的發(fā)生〔7〕。本研究提示NSCLC中HPV感染與P53基因突變密切相關(guān)。HPV16、18型E6通過(guò)降解野生型P53蛋白，使其失去對(duì)細(xì)胞DNA的監(jiān)視作用，最終使得P53基因突變得以復(fù)制和積累〔8〕。HPV感染誘導(dǎo)P53基因突變可能成為NSCLC多步驟進(jìn)程中的起始環(huán)節(jié)。

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境特征之一。在細(xì)胞缺氧時(shí)，細(xì)胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進(jìn)腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋接受腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達(dá)，如此形成惡性循環(huán)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移〔9〕。本研究結(jié)果提示HIF-1α在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Ravir等〔10〕認(rèn)為，野生型P53蛋白可通過(guò)直接抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性和通過(guò)促進(jìn)mdm2介導(dǎo)的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解兩種形式抑制HIF-1α活性。在P53缺失或突變的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，HIF-1α明顯積聚。本研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。HIF-1α與HPV感染之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外研究較少，其可能的聯(lián)系有：HPV16、18型E6可以通過(guò)降解野生型P53蛋白，并誘導(dǎo)P53基因突變，從而促進(jìn)HIF-1α的積聚。本研究發(fā)現(xiàn)HPV DNA陽(yáng)性組HIF-1α的表達(dá)率稍高于陰性組，可能由于HPV通過(guò)P53對(duì)HIF-1α的影響是有限的，兩者的關(guān)系有待今后進(jìn)一步的深入研究。本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α的表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Swinson等〔11〕的結(jié)果基本一致。高分化型HIF-1α的表達(dá)率低于中、低分化型，推測(cè)腫瘤分化程度降低，缺氧程度明顯加重，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與缺氧反應(yīng)元件作用便利于腫瘤克服缺氧并誘導(dǎo)新生血管形成，浸潤(rùn)生長(zhǎng)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。有研究報(bào)道HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)其下游基因VEGF誘導(dǎo)腫瘤新生淋巴管形成；同時(shí)上調(diào)COX-2，促使癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移，提示HIF-1α是NSCLC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵步驟，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一，HPV感染降解野生型P53蛋白，誘導(dǎo)P53基因突變，從而促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展。HIF-1α不但在NSCLC發(fā)生發(fā)展中起重要作用，還參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此選用HPV疫苗預(yù)防高危HPV感染，采用藥物或應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α基因表達(dá)有可能成為肺癌預(yù)防和治療的新方向。

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〔2013-11-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)