李宏英，李強華

（中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，江西南昌 330200）

改良培養(yǎng)基生產(chǎn)仔豬副傷寒活疫苗的研究

李宏英，李強華

（中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，江西南昌 330200）

為提高仔豬副傷寒活疫苗質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，使用某培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基，添加0.75%的水解乳蛋白，配制成合成培養(yǎng)基（以下稱改良培養(yǎng)基），用于仔豬副傷寒活疫苗（C500株）的生產(chǎn)，同時與自制培養(yǎng)基進行比較。結(jié)果表明，改良培養(yǎng)基培養(yǎng)的活菌數(shù)平均達到515×108CFU·mL-1，高于自制培養(yǎng)基水平（450×108CFU·mL-1）；改良培養(yǎng)基生產(chǎn)的6批活疫苗活菌率達50%以上，分別用兔做安全檢驗、產(chǎn)品經(jīng)12個月的保存后計活菌數(shù)，均符合《中華人民共和國獸藥典》2010年版三部[1]的質(zhì)量要求。試驗表明，改良培養(yǎng)基替代自制培養(yǎng)基用于仔豬副傷寒活疫苗（C500株）的生產(chǎn)是可行的，并能降低生產(chǎn)成本。

仔豬副傷寒；改良培養(yǎng)基；菌液活菌數(shù)

仔豬副傷寒是由豬霍亂沙門氏菌（almonella choleraesuis）引起的急性、亞急性或慢性傳染病，它是一種條件性傳染病。主要發(fā)生于2～4月齡仔豬，急性病例表現(xiàn)為敗血癥，慢性病例表現(xiàn)為消瘦和壞死性腸炎。該病全國都有發(fā)生，對養(yǎng)豬業(yè)的危害很大，預(yù)防該病主要使用弱毒活疫苗[3]?！吨腥A人民共和國獸用生物制品操作規(guī)程》2000年版[2]（以下簡稱“規(guī)程”）中仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)主要采取灌體培養(yǎng)，培養(yǎng)基是由生產(chǎn)企業(yè)自行配制的含1%～1.5%蛋白胨的普通肉湯。商品化仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基使用方便，按一定比例加入注射用水配制即可。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，對仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基進行了改良，分別對改良培養(yǎng)基與自制培養(yǎng)基生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量和成本進行了比較。

1 材料

1.1 主要材料

牛肉（自購黃牛肉）、月示蛋白胨（北京奧博星20090902批）、仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基（某廠）、水解乳蛋白（美國BD公司）、豬油（定點購買），葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、明膠、蔗糖，均購自上海國藥集團。

1.2 實驗動物

普通級大耳白兔，體重1.5～2.0kg，購自定點兔廠。

1.3 檢驗用培養(yǎng)基

普通瓊脂平板、硫乙醇酸鹽酸鹽培養(yǎng)基、酪胨瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(江西生物藥廠)。

1.4 菌種

豬霍亂沙門氏菌C500弱毒株（CCVCC79500）來自江西生物藥廠。

2 方法

2.1 自制培養(yǎng)基生產(chǎn)仔豬副傷寒活疫苗方法

2.1.1 含1 %～1.5%蛋白胨的普通肉湯培養(yǎng)基制備。使用凍冰牛肉、月示蛋白胨、氯化鈉，按“規(guī)程”要求配制成營養(yǎng)肉湯，使用8%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.2～7.6，進罐培養(yǎng)基30×104mL。

2.1.2 培養(yǎng)基在線滅菌液體。培養(yǎng)基使用水泵通過管道打進罐內(nèi)，加入豬油做消泡劑，116℃滅菌40min。

2.1.3 細菌培養(yǎng)及菌液制備。生產(chǎn)用一級種子和二級種子按“規(guī)程”要求進行選育和繁殖，進灌培養(yǎng)按2%的接種量接入二級種子，通氣培養(yǎng)，每小時測pH值一次，pH值超過7.5以上時用40%葡萄糖溶液調(diào)節(jié)pH值，培養(yǎng)至21h結(jié)束，使用冷卻水冷卻后續(xù)流高速離心濃縮，收集菌體取樣進行純粹檢驗和活菌計數(shù)，24h后根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，決定每頭份的投入活菌數(shù)，加一定比例的明膠蔗糖保護劑，配苗、分裝、凍干、軋蓋、貼簽。

2.2 改良培養(yǎng)基生產(chǎn)仔豬副傷寒活疫苗方法

2.2.1 每次30×104mL，在商品化仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上按0.75%比例加入水解乳蛋白配成改良培養(yǎng)基，使用8%氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH值7.2～7.4，配制的液體培養(yǎng)基進罐方式和滅菌溫度、接種量、培養(yǎng)方式等與自制培養(yǎng)基一致，后續(xù)工藝與自制培養(yǎng)基相同。

2.3 用3 批自制培養(yǎng)基生產(chǎn)6批（1001001、1001002、1001003、1001004、1001005、1010006）仔豬副傷寒活疫苗產(chǎn)品，3批改良培養(yǎng)基生產(chǎn)6批（1006022、1006023、1011024、1011025、1011026、1011027）仔豬副傷寒活疫苗產(chǎn)品，對菌液菌數(shù)進行活菌計數(shù)，凍干后產(chǎn)品依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2010年版[1]依次進行安全檢驗、活菌計數(shù)、凍干后活菌率及保存期試驗，比較兩種培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。

3 結(jié)果

3.1 各產(chǎn)品生產(chǎn)和檢驗結(jié)果

改良培養(yǎng)基生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗C500株，菌液活菌數(shù)達到自制培養(yǎng)基生產(chǎn)的水平，凍干后的11批產(chǎn)品依次進行安全檢驗、活菌計數(shù)、凍干后活菌率檢驗，結(jié)果均符合要求（表1）。

表1 11批產(chǎn)品生產(chǎn)、檢驗結(jié)果

3.2 凍干產(chǎn)品保存期試驗

對改良培養(yǎng)基生產(chǎn)的6批仔豬副傷寒活疫苗產(chǎn)品保存12個月后進行活菌計數(shù)，每頭份含菌數(shù)在3.0×109CFU以上，均達到《中華人民共和國獸藥典》2010年版[1]要求,為制定該產(chǎn)品內(nèi)控質(zhì)量標準提供技術(shù)參數(shù)（表2）。

表2 改良培養(yǎng)基生產(chǎn)產(chǎn)品保存期試驗結(jié)果

3.3 生產(chǎn)成本分析

以2010年的原材料價格為例，使用改良培養(yǎng)基，大幅度降低了生產(chǎn)成本，并且節(jié)約了煮牛肉的蒸汽的能耗，減輕生產(chǎn)人員的勞動強度，節(jié)省勞動力成本（表3）。

表3 自制培養(yǎng)基與改良培養(yǎng)基成本對比

4 討論

有關(guān)仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)培養(yǎng)基多有報道，張金平等[4]仔豬副傷寒（C500株）培養(yǎng)菌數(shù)比較試驗顯示,分別進行仔豬副傷寒C500通氣培養(yǎng)試驗,生產(chǎn)了16批疫苗,其平均培養(yǎng)活菌數(shù)為456×108CFU/ mL；馬振宇等[5]仔豬副傷寒活疫苗半合成培養(yǎng)基的配方篩選試驗表明，用半合成培養(yǎng)基生產(chǎn)該產(chǎn)品，平均培養(yǎng)活菌數(shù)為421×108CFU/mL，本試驗結(jié)果表明,平均培養(yǎng)活菌數(shù)均高于以上試驗結(jié)果。

自制培養(yǎng)基需要采購牛肉，冷凍儲存，牛肉價格高，并且價格一直在攀升，來源不同，質(zhì)量難以保證。配制培養(yǎng)基前需提前融化冰凍的牛肉，粉碎加工、浸泡、煮湯、過濾等需要3d的時間才能完成，生產(chǎn)周期長。商品化的仔豬副傷寒干粉培養(yǎng)基，購買方便，添加0.75%水解乳蛋白就可以配制而成改良培養(yǎng)基，按比例加入注射用水溶解、煮沸，使用8%氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH值即可使用。它具有保存條件要求低、使用簡便的優(yōu)勢，并便于生產(chǎn)計劃的調(diào)整，降低人員勞動強度，節(jié)省人力資源成本。

本試驗通過改良培養(yǎng)基對仔豬副傷寒C500株進灌培養(yǎng)試驗效果的分析,研制出比“規(guī)程”所用自制培養(yǎng)基更優(yōu)的改良培養(yǎng)基,并用此培養(yǎng)基制備的6批疫苗菌液活菌數(shù)均高于自制培養(yǎng)基,產(chǎn)品凍干后活菌率均高于50%,安全檢驗及其他項目均檢驗合格,產(chǎn)品保存期試驗結(jié)果均達到《中華人民共和國獸藥典》2010年版[1]要求,并達到了自制培養(yǎng)基的水平；生產(chǎn)成本遠遠低于自制培養(yǎng)基,僅占自制培養(yǎng)基的1/3，并節(jié)省了人力，因此，改良培養(yǎng)基替代自制培養(yǎng)基用于仔豬副傷寒活疫苗（C500株）的生產(chǎn)是可行的。

[1]中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典[S].2010年版（第三部）．

[2]中華人民共和國獸用生物制品操作規(guī)程[S].2000年版，164～166，附錄399～400.

[3]王明俊主編.獸用生物制品學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1997，481.

[4]張金平，孫繼強，楊麗平，等.仔豬副傷寒（C500株）培養(yǎng)菌數(shù)比較試驗[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會生物制品學(xué)會分會第十次學(xué)術(shù)研討會論文集，2005，222～224.

[5]馬振宇，張大鵬，劉欣，等.仔豬副傷寒活疫苗半合成培養(yǎng)基的配方篩選試驗[J].中國獸藥雜志,2005,39(4):13～14.

1004-2342（2015）01-0016-02

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2014-11-27）