王榮民，隋鶴鳴，孟飛，朱芳賢，陳國良，婁佑武，劉丑生，姜樹林

（1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西南昌 330046；2.全國畜牧總站）

錦江牛保種胚胎制作效果初探

王榮民1，隋鶴鳴2，孟飛2，朱芳賢2，陳國良1，婁佑武1，劉丑生2，姜樹林1

（1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西南昌 330046；2.全國畜牧總站）

為加快牛冷凍胚胎生物保種技術(shù)的應(yīng)用推廣，探索冷凍胚胎制作方法及效果，選擇年齡16月齡至6歲的錦江母牛20頭，分成初產(chǎn)母牛組（8頭）和經(jīng)產(chǎn)母牛組（12頭）2組，采取同期發(fā)情、超數(shù)排卵、人工授精、沖胚、胚胎鑒定和冷凍保存等方法，采集制作錦江牛的冷凍胚胎并對其效果進行分析。結(jié)果表明，經(jīng)產(chǎn)和青年2組牛同步發(fā)情征狀明顯分別占83.3%和87.5%，差異不顯著（P＞0.05）；胚胎采集方面：胚胎總數(shù)經(jīng)產(chǎn)牛頭均（7枚）是青年牛（6.3枚）的111.1%，A級、B級胚胎經(jīng)產(chǎn)牛頭均（5.4枚）是青年牛（2.7枚）的2倍。同期發(fā)情、超數(shù)排卵效果明顯；年齡在3歲左右的經(jīng)產(chǎn)母牛冷凍胚胎采集制作效果更好。

錦江牛；冷凍胚胎；制作方法；效果

錦江牛是人們經(jīng)過長期選育而形成的江西優(yōu)良地方品種，非常適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀粭l件且具有較好的產(chǎn)肉性能。但體格小、生長速度慢。近年來，為了提高其生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益，產(chǎn)區(qū)積極引進推廣外來品種牛開展雜交改良，推動了當(dāng)?shù)厝馀．a(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，但同時也造成純種錦江牛養(yǎng)殖的范圍縮小和數(shù)量急劇下降，為了更好地保護這一優(yōu)良品種，地方和國家陸續(xù)建立了保護區(qū)和資源場，對錦江牛遺傳資源保護工作起到了積極的作用。由于大牲畜活體保護受資金投入多、占用場地大、群體和個體生理利用年限短等資金和技術(shù)因素的制約，嚴重影響保護效果。利用生物技術(shù)保存畜禽遺傳物質(zhì)（冷凍精液、冷凍卵子、胚胎、體細胞和胚胎干細胞等）顯得尤為重要。冷凍胚胎技術(shù)是指通過特殊的保護措施和降溫程序，使胚胎在-196℃條件下停止代謝，而升溫后又恢復(fù)代謝能力的一種技術(shù)措施。胚胎冷凍技術(shù)實現(xiàn)了胚胎在不同地域間交流、建立優(yōu)良品種胚胎庫、促進胚胎移植在畜牧業(yè)生產(chǎn)和動物保護中的應(yīng)用和推廣[1]。1950年，英國的Polge和Smith等人發(fā)現(xiàn)了甘油用于冷凍保存牛精液,并于1951年授精產(chǎn)下世界上第一頭用凍精受胎的牛犢,這是超低溫冷凍保存技術(shù)在養(yǎng)牛業(yè)上應(yīng)用的第一個飛躍[2]。1972年，Whittingham等首先報道鼠胚胎冷凍成功。1973年，Wilmut和Rowson又在-196℃液氮下冷凍牛胚胎獲得成功[1]。80年代胚胎冷凍技術(shù)作為一項家畜保種技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。為了加強錦江牛的資源保護，全國畜牧總站在江西啟動了錦江?；驇斓慕ㄔO(shè)。本文詳細闡述了利用冷凍胚胎保存技術(shù)在錦江牛生物保種中首次應(yīng)用的方法和效果，為推動江西其他地方品種牛冷凍胚胎基因庫建立提供科學(xué)的借鑒。

1 材料和方法

1.1 供體牛的準備

選擇符合錦江牛的品種外貌特征，健康、無傳染性疾病和遺傳疾病，年齡16月齡至6歲以下，且經(jīng)直腸檢查具有良好繁殖能力的母牛20頭，根據(jù)產(chǎn)犢、年齡將其分成初產(chǎn)母牛組（8頭）和經(jīng)產(chǎn)母牛組（12頭）。

1.2 藥品

新西蘭DEC國際有限公司生產(chǎn)的黃體酮陰道緩釋劑；FSH采用日本共立制藥株式會社生產(chǎn)，規(guī)格：10A.U.×5管；黃體酮注射液由寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1mL/50mg×10支；促黃體素釋放激素A3（促排3號）由寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：20μg×10支；氯前列醇注射液由上海市計劃生育科學(xué)研究所產(chǎn)，規(guī)格：2mL/0.2mg。

1.3 方法

1.3.1 同期發(fā)情及超數(shù)排卵。試驗牛確定后單獨組群進行短期優(yōu)飼，分兩批分別在母牛發(fā)情周期的任何一天放置黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），放置CIDR時為處理周期第0d，處理周期第9 d開始肌肉注射FSH，連續(xù)4d遞減注射，每天07∶00和19∶00各一次，第5次注射FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇（PG）0.6mg，第6次注射FSH的同時肌肉注射氯前列烯醇0.4mg，第7次注射FSH的同時撤栓，并用0.9%的生理鹽水鹽水沖洗陰道，第8次注射FSH前觀察發(fā)情，未發(fā)情者繼續(xù)注射FSH，第2d繼續(xù)觀察發(fā)情。并分別于第一次注射FSH和配種時各肌注維生素ADE5mL。詳見表1。

表1 母牛超排處理方案

1.3.2 人工授精。試牛在第12d后開始試情觀察，第13d發(fā)現(xiàn)母牛有發(fā)情表現(xiàn)后即開始配種，要求每頭牛配種2～3次,配種時肌注促黃體素釋放激素A32支。

1.3.3 沖胚

1.3.3.1 保定。供體母牛于保定架內(nèi)站立保定，一般取前高后低的姿勢。

1.3.3.2 尾椎硬外膜麻醉。將第一、第二尾椎間的毛剪掉，用酒精棉球進行消毒，然后注射煙酸利多卡因(普魯卡因)，進針的深度根據(jù)注射時的手推阻力，一般感覺阻力很小即進針，否則應(yīng)改變進針的深度。藥物用量依照牛的體型大小和牛對藥物的敏感性而定，一般3～5mL，如果麻藥劑量過大，容易引起腸壁肌肉舒張，后軀站立不穩(wěn)，給操作帶來困難。

1.3.3.3 外陰部的清洗和消毒。麻醉后，將牛尾系向一側(cè)，清除直腸內(nèi)的宿糞，然后清洗外陰部。一般先用溫水或肥皂水洗凈，再用衛(wèi)生紙擦干，最后用酒精棉球擦拭外陰部和陰道口周圍。

1.3.3.4 采卵管的插入和固定。對于子宮頸難通過的供體牛，應(yīng)先用子宮頸擴張棒充分擴張子宮頸后將帶有不銹鋼絲的采卵管插入子宮角，邊向外拔出鋼絲邊向前推進采卵管，將采卵管遞到子宮角前段。然后由助手向氣球內(nèi)流入空氣(也可以使用沖卵液代替空氣)，氣體的注入量由子宮角的大小及采卵管插入的深淺而定，一般8～15mL。

1.3.3.5 沖卵液的注入和導(dǎo)出。采卵管固定好以后，抽出不銹鋼絲，將導(dǎo)管接好，注入沖卵液。沖卵液注入的量根據(jù)手在直腸內(nèi)感覺子宮角的膨脹度而定，一般20～50mL，如果沖卵液回流不暢，可將子宮角前段上提，這樣將有助于液體的回流。如此反復(fù)幾次，每測子宮角的用液量一般在200～300mL，最后一次可以使用注射器強制回流。沖完一側(cè)后，換另一側(cè)繼續(xù)沖洗，方法相同。

1.3.3.6 子宮內(nèi)注入抗生素等物質(zhì)。兩側(cè)子宮角沖洗完畢后，為了預(yù)防子宮內(nèi)的感染，要向子宮內(nèi)投入一定量的抗生素。另外，為了防止殘留胚胎造成妊娠，在注入抗生素的同時注入氯前列腺烯醇(PG)。

1.3.4 胚胎的檢查

1.3.4.1 檢胚。將收集到的沖卵液靜置10min，等胚胎下沉后移去上層液，直接吸取底部液體，然后置于實體顯微鏡下檢胚。檢到的胚胎應(yīng)及時移入含有20%犢牛血清的PBS培養(yǎng)液中25℃環(huán)境溫度下進行鑒定。

1.3.4.2 胚胎鑒定。在120～160倍的生物顯微鏡下對胚胎進行評定。正常發(fā)育胚胎透明帶完整，形態(tài)規(guī)則，色調(diào)均勻一致，透明度適中。根據(jù)形態(tài)學(xué)及發(fā)育程度劃分，胚胎質(zhì)量分為A、B、C、D四個等級。

A級：胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，色調(diào)和透明度適中，胚胎細胞團呈均勻?qū)ΨQ的球形，透明帶光滑完整,厚度適中，不規(guī)則的細胞相對較少，變性細胞不高于15%。

B級：胚胎形態(tài)較完整，輪廓清晰，色調(diào)及細胞密度良好，透明帶光滑完整,厚度適中，存在一定數(shù)量大小和形狀不規(guī)則的細胞或細胞團，有一定數(shù)量細胞的顏色明暗不一、密度不均勻，但變性細胞不高于50%。

C級：胚胎形態(tài)不完整，輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，結(jié)構(gòu)較松散，游離的細胞較多，但變性細胞不高于75%。

D級：包括退化的胚胎、未受精卵或1細胞胚胎，及16細胞以下的受精卵，細胞團有較多碎片、輪廓不清晰、結(jié)構(gòu)松散，變性細胞比例高于75%。

1.3.5 胚胎冷凍

1.3.5.1 保存液抽取。取9mL含20%胎牛血清的DPBS液，加入1mL甘油，用吸管反復(fù)吹吸混合15次～20次，經(jīng)0.22μm濾器過濾到滅菌容器內(nèi)待用。

1.3.5.2 平衡。將胚胎直接移入10%的甘油冷凍保存液,平衡10min后，迅速裝管冷凍。

1.3.5.3 裝管。使用0.25mL細管。裝管順序：乙二醇冷凍保護液，氣泡，乙二醇冷凍保護液，氣泡，含有胚胎的乙二醇冷凍保護液，氣泡，冷凍保護液，氣泡，乙二醇冷凍保護液，每支細管裝1～2枚胚胎。用封品塞封口。

1.3.5.4 標記。生產(chǎn)單位、品種、公牛號、供體牛號、胚胎發(fā)育期、等級、數(shù)量和生產(chǎn)時間。

1.3.5.5 植冰。將裝有胚胎的細管放入預(yù)冷至-6℃或-7℃的冷凍儀內(nèi)，平衡5min，用經(jīng)液氮冷卻后的鑷子夾塑料細管封口端植冰。

1.3.5.6 冷凍。植冰后，平衡10min，以0.3℃/min速率降溫，降到-35℃時，平衡5min，直接投入液氮中保存。

1.5 觀察記錄

期間對每頭牛的采食情況、健康狀況、發(fā)情征狀進行日常觀察，對胚胎形態(tài)進行鑒定做好記錄，并對符合要求的A級和B級胚胎進行冷凍保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體牛發(fā)情情況

表2 供體牛發(fā)情表現(xiàn)頭，%

由表2分析可知，發(fā)情征狀（爬跨、外陰紅腫、不明顯）方面經(jīng)產(chǎn)牛、青年牛發(fā)情征狀明顯，分別占83.3%和87.5%（P＞0.05）。

2.2 胚胎采集效果

由表3可知，A級、B級胚胎：經(jīng)產(chǎn)牛頭均5.4枚，是青年牛（2.7枚）的2倍，胚胎采集總數(shù)：經(jīng)產(chǎn)牛頭均（7枚）是青年牛（6.3枚）的111.1%，因此本次不論在胚胎總數(shù)、可凍胚胎數(shù)方面經(jīng)產(chǎn)牛均優(yōu)于青年牛。

表3 供體牛胚胎采集制作情況頭，枚，%

3 小結(jié)

3.1 本次冷凍胚胎制作是結(jié)合多年來反復(fù)試驗和操作實踐，在藥物選擇、方法和劑量等方面更加科學(xué)、規(guī)范，同期發(fā)情、超數(shù)排卵效果明顯，表現(xiàn)為同步有明顯發(fā)情征狀達83.3%以上，胚胎沖出總數(shù)頭均在6.3枚以上。

3.2 本次試驗表明，年齡在3歲左右的經(jīng)產(chǎn)母牛冷凍胚胎采集制作效果更好，但經(jīng)產(chǎn)母牛產(chǎn)科疾病較多，要有更多的個體供選擇。

3.3 本文對錦江牛同期發(fā)情、胚胎采集及胚胎的制作等技術(shù)方法進行了詳細敘述，為今后江西其他地方品種牛開展生物保種技術(shù)提供了參考依據(jù)。

[1]石玉強，等.哺乳動物胚胎冷凍技術(shù)的研究進展[J].萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報2002.19（1）：71～74.

［2］王曉陽.超低溫冷凍保存技術(shù)在養(yǎng)牛業(yè)上的應(yīng)用[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué).1997（1）：90～93.

［3］桑潤滋，等.提高牛冷凍胚胎成活率和移植受胎率的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.1994,19(2)：97～101.

1004-2342（2015）01-0013-03

S814.6

B

2015-01-09）

家畜遺傳物質(zhì)制作保存項目