（華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國(guó)家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050015）

達(dá)托霉素是具有獨(dú)特環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂肽類(lèi)抗生素［1］，由玫瑰孢鏈霉菌（Streptomycesroseosporus）發(fā)酵產(chǎn)生，它能通過(guò)阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的生成和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的功能等方式殺死細(xì)菌［2－3］，作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，故不易產(chǎn)生耐藥菌。達(dá)托霉素的抗菌譜與萬(wàn)古霉素類(lèi)似，且在體外對(duì)萬(wàn)古霉素、甲氧西林、利奈唑烷等的耐藥菌也具有強(qiáng)烈活性，因此成為目前臨床上公認(rèn)的繼萬(wàn)古霉素之后最理想的備用抗生素［4－9］。鑒于以上特殊優(yōu)勢(shì)，達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，篩選適合工業(yè)化生產(chǎn)所需的高產(chǎn)菌株迫在眉睫。

復(fù)合誘變法是指在誘變育種中使用2種或2種以上的誘變方法處理菌株，以提高菌株的誘變效果［10］。作者在此采用氦氖（He－Ne）激光輻照－亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變達(dá)托霉素產(chǎn)生菌HK402，以期獲得高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定性好的達(dá)托霉素產(chǎn)生菌。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與儀器

玫瑰孢鏈霉菌（Sterptomycesroseosporus）HK402，由微生物藥物國(guó)家工程研究中心菌種保藏庫(kù)提供。

搖床，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，He－Ne－1000型氦氖激光儀。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：糊精1%，葡萄糖0.5%，玉米漿0.5%，K2HPO4·3H2O 0.04%，MgSO4·7H2O 0.1%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，淀粉1.3%，冷榨豆餅粉1.5%，蛋白胨1%，CaCO30.5%，MgSO4·7H2O 0.3%，前體0.8%。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取生長(zhǎng)好的斜面，用接種鏟挖塊1cm2左右接入種子瓶中，28 ℃、220r·min－1培養(yǎng)36h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將搖瓶種子按4%的接種量接入250 mL裝量為40mL的發(fā)酵瓶中，28℃、220r·min－1培養(yǎng)118h。

1.3.2 誘變方法

1）單孢子菌懸液的制備

取生長(zhǎng)好的成熟斜面，加入適量無(wú)菌生理鹽水，輕輕刮下孢子后將孢子液移入無(wú)菌玻璃珠瓶中充分振蕩打散，過(guò)濾后將孢子數(shù)調(diào)到106個(gè)·mL－1，待用。

2）亞硝基胍溶液的配制

在通風(fēng)櫥中稱(chēng)取100mg 亞硝基胍于棕色容量瓶中，加入少量丙酮使其溶解，最后用乙醇定容至10 mL，使終濃度為10mg·mL－1，待用。

3）氦氖激光輻照誘變

取適量單孢子菌懸液于石英皿中進(jìn)行氦氖激光輻照，激光燈功率為18mW，照射距離為20cm，分別照射10min、20min、30min、40min、50min、60min；將處理過(guò)的菌懸液梯度稀釋后涂平板，28 ℃培養(yǎng)7d，待菌落成熟后計(jì)算致死率。挑選菌落形態(tài)好、孢子豐富的菌落傳斜面，進(jìn)行搖瓶初篩，并根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算正突變率。

4）亞硝基胍誘變

取適量單孢子菌懸液于10mL 無(wú)菌離心管中，分別用終濃度（mg·mL－1）為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的亞硝基胍處理30min，離心，棄上清，用pH 值為6.5的磷酸緩沖溶液洗滌菌體3次以終止反應(yīng)，最后用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋涂平板，待菌落成熟后計(jì)算致死率。挑選生長(zhǎng)健壯、孢子豐富的菌落傳斜面，進(jìn)行搖瓶初篩，并根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算正突變率。

5）氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變

在最佳誘變劑量下復(fù)合處理出發(fā)菌株HK402，將處理后的單孢子菌懸液梯度稀釋后涂平板，進(jìn)行菌落初篩和搖瓶初篩，根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算致死率和正突變率。

1.3.3 計(jì)算與檢測(cè)方法

1）致死率和正突變率的計(jì)算

2）發(fā)酵單位的測(cè)定

采用HPLC法［11］測(cè)定發(fā)酵單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 氦氖激光輻照誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

將HK402的無(wú)菌菌懸液用氦氖激光輻照不同時(shí)間后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 氦氖激光輻照不同時(shí)間后的致死率和正突變率／%Tab.1 Death rate and positive mutation rate after irradiating different time by He－Ne laser／%

由表1可知：隨著氦氖激光輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率逐漸升高；在輻照40min時(shí)菌株的致死率達(dá)到78.2%，此時(shí)正突變率最高，為25.3%；繼續(xù)延長(zhǎng)輻照時(shí)間，菌株的致死率趨于平穩(wěn)，但正突變率逐漸降低。因此，氦氖激光輻照誘變時(shí)間以40min為宜。

出發(fā)菌株HK402 經(jīng)氦氖激光輻照不同時(shí)間后，篩選得到了發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高10%的正突變菌株共68株，其中有7株為誘變40min的菌株，其發(fā)酵單位較出發(fā)菌株高20%以上，菌株14－8－102發(fā)酵單位最高，比出發(fā)菌株高25%。

2.2 亞硝基胍誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

將HK402的無(wú)菌菌懸液用不同濃度的亞硝基胍溶液處理后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度亞硝基胍誘變后的致死率和正突變率Fig.1 Death rate and positive mutation rate after mutated by different concentrations of NTG

由圖1可知：隨著亞硝基胍濃度的增大，菌株的致死率逐漸升高；在亞硝基胍濃度為0.8mg·mL－1時(shí)菌株的致死率達(dá)到75.5%，此時(shí)正突變率最高，為28.1%；繼續(xù)增大亞硝基胍濃度至1.2mg·mL－1時(shí)，菌株的致死率接近100%，正突變率卻降低到5.3%。因此，亞硝基胍誘變濃度以0.8mg·mL－1為宜。

HK402經(jīng)亞硝基胍誘變后，從0.8mg·mL－1劑量組中篩選到了發(fā)酵單位最高的菌株14－9－196，比出發(fā)菌株高19%。

2.3 氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

用氦氖激光輻照和0.8mg·mL－1的亞硝基胍溶液復(fù)合處理出發(fā)菌株HK402，氦氖激光輻照時(shí)間為40min，亞硝酸胍處理時(shí)間為30 min，篩選得到了10株高產(chǎn)菌株，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98的發(fā)酵單位最高，比出發(fā)菌株HK402高35%，比單用氦氖激光輻照誘變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102高8%，比單用亞硝基胍誘變得到的高產(chǎn)菌株14－9－196高13%。

圖2 氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變結(jié)果Fig.2 Results of complex mutagenesis of He－Ne laser irradiation and NTG

2.4 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性考察

將誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，以出發(fā)菌株HK402為對(duì)照（發(fā)酵單位以100計(jì)），考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of the high producing strains

由圖3可見(jiàn)：?jiǎn)我徽T變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102和14－9－106的遺傳穩(wěn)定性都不好，發(fā)酵單位從2代斜面開(kāi)始就發(fā)生回落，傳代4次以上菌株的高產(chǎn)特性基本消失；而復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98在斜面?zhèn)鞔?次的遺傳穩(wěn)定性仍然較好，是一株已具備上罐條件的高產(chǎn)菌株。

3 結(jié)論

用氦氖激光輻照和亞硝基胍誘變達(dá)托霉素產(chǎn)生菌HK402，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用氦氖激光輻照誘變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高25%；單獨(dú)使用亞硝基胍誘變得到的高產(chǎn)菌株14－9－196的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高19%；采用氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高35%。采用氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變較單一誘變的效果好，而且高產(chǎn)菌株傳代5代后遺傳穩(wěn)定性良好。

［1］RICHARD A L，WILLIAM V C，DONALD B B.Lipodepaipeptide antibiotics and methods of preparation：US，6767718［P］.2004－07－27.

［2］RAJA A，LaBONTE J，LEBBOS J，et al.Fresh from the pipeline：Daptomycin［J］.Nat Rer Drug Discor，2003，2（12）：943－944.

［3］CUNHA B A，HAMID N，KESSLER H，et al.Daptomycin cure after cefazolin treatment failure of Methicillin－sensitiveStaphylococcusaureus（MSSA）tricuspid valve acute bacterial endocarditis from a peripherally inserted central catheter（PICC）line［J］.Heart Lung，2005，34（6）：442－447.

［4］盧文玉，聞建平，范晶華，等.癸酸抗性突變株流加發(fā)酵法生產(chǎn)達(dá)托霉素［J］.天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，39（B06）：20－24.

［5］劉伯寧，石磊，蔣沁.環(huán)脂肽類(lèi)抗生素研究進(jìn)展［J］.中國(guó)抗生素雜志，2007，32（9）：520－524.

［6］趙增任，唐巍，趙晉.新型抗生素藥物——達(dá)托霉素［J］.科教文匯，2008，（4）：197.

［7］JOHNSON A P，MUSHTAQ S，WAMER M，et al.Activity of daptomycin against multi－resistant Gram－positive bacteria including enterococci andStaphylococcusaureusresistant to linezolid［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2004，24（4）：315－319.

［8］HOJATI Z，MILNE C，HARVEY B，et al.Structure，biosynthetic origin，and engineered biosynthesis of calcium－dependent antibiotics fromStreptomycescoelicolor［J］.Chemistry and Biology，2002，9（11）：1175－1187.

［9］BELL J M，TURNIDGE J D.High prevalence of oxacillin－resistantStaphylococcusaureusisolates from hospitalized patients in Asia－Pacific and South Africa：Results from SENTRY antimicrobial surveillance program，1998－1999［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，46（3）：879－881.

［10］李榮杰.微生物誘變育種方法的研究進(jìn)展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（10）：73－76，78.

［11］VASSELLE B，GOUSSET G，BOUNINE J P.Development and validation of a high－performance liquid chromatographic stabilityindicating method for the analysis of Synercid in quality control，stability and compatibility studies［J］.J Pharm Biomed Anal，1999，19（5）：641－657.