于新友，李天芝，王金良，李 峰，沈志強(qiáng)，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬圓環(huán)病毒2型SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測方法的建立

于新友1，李天芝1，王金良2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

為了建立豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，采用PCR擴(kuò)增PCV2 ORF2基因242 bp片段，并克隆入pMD18-T載體中，以純化的重組質(zhì)粒為模板作熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了PCV2熒光定量PCR檢測方法，該方法檢測靈敏度可達(dá)1.2×101拷貝/μL，與豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、乙型腦炎病毒（JEV）核酸均不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，具有很好的特異性和重復(fù)性。結(jié)果表明：建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PCV2的檢測。

豬圓環(huán)病毒2型；ORF2基因；SYBR?Green?I；熒光定量PCR

豬圓環(huán)病毒依據(jù)其致病性和基因組差異分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）[1]的主要病原，此外，PCV2還與豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、豬呼吸道綜合征(PRDC)及繁殖障礙以及腸炎等疾病有關(guān)[2]，是一種免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。2000年，我國首次報(bào)道了PCV2感染，目前，PCV2感染在我國豬群廣泛流行，種豬有很高感染率，與其他疾病混合感染現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床上表現(xiàn)為不同的綜合征。

PCV2的傳統(tǒng)檢測方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法和免疫組化法等，這些方法均有很多缺點(diǎn)：如耗時(shí)長、檢測敏感性較低及準(zhǔn)確性差等。為調(diào)查山東省PCV2的流行情況，筆者根據(jù)GenBank公布的PCV2基因（DQ104423）序列建立了PCV2 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，并用該法對(duì)采自山東省各地的PCV2疑似病料進(jìn)行檢測。

1??材料和方法

1.1?病毒株與病料

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、乙型腦炎病毒（JEV）由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存，臨床疑似病料為2014年1—11月采自山東省各地豬場臨床診斷為PCV2感染豬的脾臟、淋巴結(jié)等。

1.2?工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、SYBR Green Ⅰ、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自大連寶生物公司，AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒從愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司購買。

1.3?PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的PCV2 ORF2基因序列（DQ104423），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增PCV2 ORF2基因242 bp片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物：5′-TATTGTAGTCCTGGTCGTATT -3′，下游引物：5′- GTCCACAG CCCTAACCTA -3′。

1.4??PCV2基因組DNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒使用說明書提取PCV2的DNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5?PCV2?ORF2基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：Premix Taq 12.5μL， 上、 下 游 引 物 各1μL(15μmol/L)，DNA 2μL，加去離子水至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴(kuò)增結(jié)果。

1.6?重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布Amp抗性固體LB瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取疑似陽性菌落接種液體LB培養(yǎng)基，搖菌，培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切方法進(jìn)行鑒定，將初步鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測序。

用紫外分光光度計(jì)測定測序正確的重組質(zhì)粒(命名為pMD18-ORF2)在260、280 nm處的吸光度，得到重組質(zhì)粒的濃度和純度，進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，作為模板，用于熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.7?熒光定量?PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以已知拷貝的重組質(zhì)粒（10倍梯度倍比稀釋）為模板進(jìn)行熒光定量PCR，通過預(yù)試驗(yàn)對(duì)PCV2 ORF2基因的SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，最終確定的最佳反應(yīng)體系為Premix Taq 12.5μL，上、下游引物各1μL(15μmol/L)，DNA 2μL，加去離子水至25μL。最佳反應(yīng)參數(shù)為95 ℃，5 min：94 ℃，15 s；52 ℃，15 s；72 ℃，15 s；共40個(gè)循環(huán)。采用軟件進(jìn)行分析，得到動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8??熒光定量?PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 PCV2 VP2基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用自己建立的PCV2 ORF2基因熒光定量PCR方法對(duì)PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV進(jìn)行檢測，選取pMD18-ORF2質(zhì)粒作陽性對(duì)照，采用滅菌水作陰性對(duì)照。將重組質(zhì)粒做10倍梯度連續(xù)倍比稀釋，將稀釋物作為模板，采用熒光定量PCR方法擴(kuò)增，計(jì)算熒光定量PCR方法能檢出的最少的模板的拷貝。為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，分別選取同一批次和不同批次的3種不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在同一批次和不同批次試驗(yàn)中進(jìn)行測定，同時(shí)增設(shè)無模板擴(kuò)增對(duì)照品（NTC）。

1.9?臨床樣品的檢測

從山東省各地豬場收集PCV2臨床疑似病料40份，用自己建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。

2??結(jié)果

2.1??PCV2?ORF2基因PCR擴(kuò)增和克隆

提取PCV2基因組DNA，作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果得到242 bp的特異性條帶(圖1)。將ORF2基因的PCR產(chǎn)物純化回收后，克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-ORF2，將擴(kuò)增的ORF2基因測序結(jié)果與GenBank中PCV2 ORF2基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與PCV2 ORF2基因?yàn)?00%。

2.2?熒光定量?PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋，取為 1.5×105，1.5×104，1.5×103，1.5×102，1.5×101拷貝/μL等5種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板做熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-3.558×lgcopies+34.48（R2=0.9994）。

2.3?溶解曲線分析

在SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)溶解曲線分析，結(jié)果如圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度Tm為81.5～82 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其他峰值出現(xiàn)。

2.4?特異性試驗(yàn)

采用已經(jīng)建立的PCV2 ORF2基因SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV和JEV等 檢 測， 只 有PCV2的樣品孔出現(xiàn)了單一的s型擴(kuò)增曲線（圖4），表明建立的PCV2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.5?敏感性試驗(yàn)

將制備的質(zhì)粒模板10倍倍比稀釋，并分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的real-time PCR擴(kuò)增曲線，采用6種不同的重組質(zhì)粒作模板濃度，分別為1.2×105，1.2×104，1.2×103，1.2×102，1.2×101，1.2×100拷貝/μL，結(jié)果顯示其靈敏度為1.2×101拷貝/μL。

2.6?重復(fù)性檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證熒光PCR檢測結(jié)果的重復(fù)性，選取3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，測定批內(nèi)和批間重復(fù)性，結(jié)果顯示，樣品的Ct值及Tm值批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于1.0%，說明該種方法的重復(fù)性好（如表1、2），陰性對(duì)照組（D組）沒有檢測到熒光信號(hào)。

2.7?臨床樣品檢測

采用試驗(yàn)建立的PCV2 ORF2基因SYBR Green I熒光定量PCR和普通PCR方法，對(duì)臨床采集的40份疑似PCV2樣品檢測，結(jié)果顯示：SYBR Green I熒光定量PCR檢測到25份陽性樣品、15份陰性樣品，而普通PCR檢測到18份陽性樣品、22份陰性樣品。表明該方法對(duì)于PCV2的檢測比普通PCR方法靈敏度高，能檢測出普通PCR不能檢測出的病料。

圖2 PCV2 VP2基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的溶解曲線

圖 4 PCV2 VP2基因特異性檢驗(yàn)動(dòng)力學(xué)曲線

表1?SYBR?GreenⅠ熒光定量PCR的重復(fù)性(Ct值)

表2?SYBR?GreenⅠ熒光定量PCR的重復(fù)性(Tm值)

3??討論

李鵬等[7]根據(jù)PCV2 ORF1設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該法靈敏度可達(dá)10～100拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測方法靈敏度高10倍，而與PRRSV、PRV、CSFV和PPV沒有交叉反應(yīng)，與常規(guī)PCR相比，該法具有較高的靈敏度和特異性。敖艷華等[8]建立了PCV2檢測的熒光定量PCR方法，該法檢測靈敏度可達(dá)1.0×102拷貝/ μL，線性范圍為101～109，達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有很好的特異性。分別測定3種不同濃度即1.0×108拷貝/μL、1.0×106拷貝/μL、1.0×104拷貝/ μL的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，測得的Ct值分別為12.77、19.72和26.89；變異系數(shù)分別為0.25%、0.10%和0.13%，均小于1%。本試驗(yàn)根據(jù)PCV2 ORF2基因部分保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了檢測PCV2的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR方法，該方法只對(duì)PCV2 DNA有陽性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV的核酸樣品均無特異性反應(yīng)，表明該方法特異性強(qiáng)，分析溶解曲線得出反應(yīng)過程中未產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，特異性產(chǎn)物的Tm值在理論值1 ℃左右波動(dòng)，屬于正常范圍[6]。該方法的表達(dá)公式-3.558×lgcopies+34.48，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測限為1.2×101拷貝/μL，比常規(guī)PCR敏感性強(qiáng)100倍，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為0.76%、0.49%、0.37%，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為0.55%、0.63%、0.69%，均小于1.0%，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律。這說明建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好，并且標(biāo)準(zhǔn)曲線也很好，具有較好的實(shí)用性。將建立的PCV2熒光定量PCR方法用于臨床病料檢測，并與常規(guī)PCR方法比較，結(jié)果表明：7份常規(guī)PCR檢測呈陰性的病料熒光定量PCR檢測為陽性，18份常規(guī)PCR檢測陽性的病料熒光定量PCR檢測仍為陽性，15份常規(guī)PCR檢測呈陰性的病料熒光定量PCR檢測仍為陰性，因此，熒光定量方法對(duì)PCV2的檢出率明顯高于常規(guī)PCR的檢出率，該方法的建立為PCV2的分子流行病學(xué)調(diào)查和疫情監(jiān)測工作的開展提供技術(shù)依據(jù)。

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2014-12-29）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)

于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究。