宮 強，李戰(zhàn)麗，牛明福，王 輝，劉永康，秦翠麗，孫曉菲

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

鼠傷寒沙門氏菌ompc基因PCR的檢測方法

宮 強，李戰(zhàn)麗，牛明福，王 輝，劉永康，秦翠麗，孫曉菲

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

建立一種鼠傷寒沙門氏菌的聚合酶鏈式反應(yīng)檢測方法。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鼠傷寒沙門氏菌的ompc的基因 序列，設(shè)計和合成了一對特異性引物，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，檢測了該方法的敏感性和特異性。結(jié)果成功擴增出了鼠傷寒沙門氏菌470 bp的ompc特異性基因片段，而對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和志賀氏菌4 種食品中常見的病原菌均未擴增出相應(yīng)片段。敏感性實驗結(jié)果表明本方法可檢測到最低1 pg/μL的鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA。

鼠傷寒沙門氏菌；ompc基因；聚合酶鏈式反應(yīng)；檢測方法

沙門氏菌是常見的腸道致病菌之一，其中部分沙門氏菌具有人畜共患性，也是重要的食源性病原微生物，可通過食品感染人從而引發(fā)食物中毒。據(jù)統(tǒng)計在全球范圍內(nèi)的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒名列榜首［1］，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首。在我國目前流行的眾多血清型中，鼠傷寒沙門氏菌是最為常見的一種，也是引起沙門氏菌食物中毒的主要血清型之一。據(jù)Helms等［2］的統(tǒng)計結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌引起的感染性疾病接近 沙門氏菌感染總數(shù)的五分之一。為預防和控制鼠傷寒沙門氏菌引起的食物中毒，除做好常規(guī)的消毒衛(wèi)生等環(huán)節(jié)外，對食品中該菌的快速檢測無疑對預防該菌引起的食物中毒具有重要的意義。然而，目前對該菌的檢測方法仍然是以傳統(tǒng)的病原分離和生化鑒定為主，雖然該方法能取得可靠的鑒定結(jié)果，但存在操作繁瑣、耗時長等許多不足之處，因此急需開發(fā)一種快速、敏感且特異的檢測方法。本研究以鼠傷寒沙門氏菌的ompc基因為基礎(chǔ)，建立了用于檢測此菌的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，以期能為鼠傷寒沙門氏菌PCR快速檢測試劑盒的研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

鼠傷寒沙門氏菌和志賀氏菌 廣東省微生物菌種保藏中心；致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌為本實驗室分離、鑒定和保存；DL-5000 Marker、dNTPs、TaqDNA聚合酶 大連寶生物工程有限公司；瓊脂原 北京鼎國生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA的提取

由保存的菌種中無菌挑取鼠傷寒沙門氏菌單個菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，取50 mL菌液以十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取鼠傷寒沙門氏菌的基因組。

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的沙門氏菌ompc基因的序列設(shè)計合成用于擴增該基因470 bp片段的特異性引物，用無菌去離子水將上下游引物均稀釋至濃度為25 μmol/L，-20 ℃凍存?zhèn)溆茫镄蛄腥缦滤荆?/p>

PU：5’-AGTTAAAGTACTGTCCCTCC-3’；PL：5’-CGAAGAAGTCGGTGTTAC-3’。

1.2.3 ompc基因的PCR擴增

以鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA為模板，以PU和PL引物進行PCR擴增目的基因，并設(shè)立無菌去離子水為模板的陰性對照。反應(yīng)體系中含模板1 μL，PU和PL引物各0.5 μL，10×PCR buffer 3 μL，dNTPs 1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，以無菌去離子水補足至總體積25 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變形性45 s；52 ℃退火25 s；72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR結(jié)束后取3 μL產(chǎn)物進行0.8%的瓊脂原凝膠電泳以檢測PCR擴增片段的大小，隨后送測序公司進行測序。

1.2.4 ompc基因PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

為探索最佳的PCR反應(yīng)條件，本實驗對反應(yīng)過程中的多個條件包括引物濃度、退火溫度、dNTPs濃度和循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，具體參數(shù)如表1所示。PCR反應(yīng)結(jié)束后各取2 μL產(chǎn)物進行0.8%的瓊脂原凝膠電泳，并以Image LabTM軟件對PCR產(chǎn)物的亮度進行分析。

表1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of PCR reaction conditions

1.2.5 敏感性實驗

以紫外分光光度計測定本實驗所提取的鼠傷寒沙門氏菌的基因組質(zhì)質(zhì)濃度，以無菌去離子水稀釋至模板質(zhì)質(zhì)濃度為1 ng/μL，隨后按照10 倍的比例進行梯度稀釋，直至模板質(zhì)質(zhì)濃度為0.1 pg/μL。隨后按上述所測得的最佳反應(yīng)條件進行擴增，同時設(shè)置無菌去離子水為模板的陰性對照，從而檢測出本實驗所建立的PCR反應(yīng)的敏感性。

1.2.6 特異性實驗

以CTAB法分別提取綠膿桿菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的基因組DNA，以鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA為陽性對照，以無菌去離子水模板做陰性對照，以本實驗所設(shè)計合成的引物，對上述各菌的基因組DNA進行PCR擴增以鑒定該PCR檢測法的特異性。PCR反應(yīng)條件如下：模板1 μL，PU和PL引物各0.5 μL（終濃度為0.25 μmol/L），10×PCR buffer 3 μL，dNTPs 1.5 μL（終濃度為0.08 mmol/L），Taq DNA聚合酶0.4 μL，以無菌去離子水補足至總體積25 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變形性45 s；56 ℃退火25 s；72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR結(jié)束后取1.5 μL產(chǎn)物進行0.8%的瓊脂原凝膠電泳以檢測是否有目的基因的產(chǎn)生，從而檢測特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠傷寒沙門氏菌ompc基因PCR擴增結(jié)果

以合成的ompc基因的特異性引物鼠傷寒沙門氏菌的基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂原凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，在470 bp處出現(xiàn)與預期大小一致目的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定與GenBank中登陸的的ompc基因序列完全一致，說明PCR擴增成功得到目的基因片段。

圖1 1 ompcompc基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplified products of ompc gene

2.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 引物濃度的優(yōu)化

圖2 引物濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of primer concentration

對PCR反應(yīng)過程中的引物濃度進行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。在本實驗所檢測的引物濃度中，當引物濃度為0.25 μmol/L時，目的條帶最明亮，因此選取每條引物濃度為0.25 μmol/L作為最佳引物濃度。

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化

對PCR反應(yīng)過程中的退火溫度進行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示，當退火溫度在56 ℃時，PCR產(chǎn)物條帶最亮，因此選擇56 ℃作為ompc基因PCR反應(yīng)的最佳退火溫度。

圖3 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of annealing temperature

2.2.3 dNTPs濃度的優(yōu)化

圖4 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization of dNTP concentration

dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。利用Image LabTM軟件分析結(jié)果顯示，在本實驗所設(shè)定的dNTPs濃度中，當dNTPs濃度為0.08 mmol/L時，目的條帶最明亮，因此選擇0.08 mmol/L為反應(yīng)的最佳dNTPs濃度。

2.2.4 循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

對PCR反應(yīng)過程中的循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示，在循環(huán)次數(shù)為23 次時可以觀察到有目的條帶出現(xiàn)，在循環(huán)29 次時即可出現(xiàn)較為明亮的條帶，之后PCR產(chǎn)物的亮度并未隨循環(huán)次數(shù)的增加而明顯升高，因此本研究選取29 次循環(huán)為最佳循環(huán)次數(shù)。

圖5 PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization of PCR cycle number

2.3 PCR反應(yīng)敏感性實驗結(jié)果

以倍比稀釋后的鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA為模板進行PCR敏感性實驗，結(jié)果如圖6所示，在模板DNA的質(zhì)低至1 pg/μL時仍能擴增出目的基因片段，而在0.1 pg/μL時則擴增不出目的條帶，由此可見本實驗所建立的PCR檢測方法的敏感度為1 pg/μL。

圖6 敏感性實驗結(jié)果Fig.6 Results of sensitivity tests

2.4 PCR擴增特異性實驗結(jié)果

圖7 特異性實驗結(jié)果Fig.7 Results of specificity tests

以本實驗所用引物，按優(yōu)化獲得的最佳反應(yīng)條件對食品中常見的致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和志賀氏菌的基因組DNA進行PCR擴增。經(jīng)Image LabTM軟件分析實驗結(jié)果，如圖7所示，以鼠傷寒沙門氏菌基因組為模板可擴增出470 bp大小的的ompc DNA片段，而在同樣的實驗條件下以致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和志賀氏菌的基因組為模板則擴增不出該DNA片段，表明本實驗的PCR檢測方法具有良好的特異性。

3 討 論

鼠傷寒沙門氏菌作為重要的食源性病原微生物之一，因其傳播途徑廣，侵染宿主多，流行較為嚴重，加之人們對食品安全的關(guān)注，使該菌引起的食物中毒越來越受到人們的關(guān)注。因此，尋求一種快速、特異且靈敏的檢測方法對于該菌進行早期檢測無疑具有重要的現(xiàn)實意義。目前，對于該菌檢測方法的研究主要是傳統(tǒng)的病原菌分離培養(yǎng)、生化鑒定等方法，該方法雖然較為準確，但操作費時［3］，而該菌引起的食物中毒來勢較急，因此該傳統(tǒng)方法不適于臨床的早期檢測。

PCR檢測技術(shù)是目前較為成熟的食品微生物檢測技術(shù)［4］，由于其在微生物檢測診斷方面具有快速、敏感等優(yōu)勢而受到人們的青睞。目前與其相關(guān)的檢測技術(shù)已成為科研人員研究的熱點之一，包括常規(guī)PCR、多重PCR、套式PCR、熒光定質(zhì)PCR技術(shù)和免疫PCR技術(shù)等［5］。該技術(shù)已應(yīng)用于多種食源性病原微生物如志賀氏菌、李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、大腸桿菌等的早期檢測中［6-10］。

本研究建立了一種基于鼠傷寒沙門氏菌ompc基因的PCR檢測方法，成功擴增出目的基因，同時針對食品中較為常見的4 類病原菌包括致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和志賀氏菌進行了PCR的特異性實驗，結(jié)果證實本實驗具有較好的特異性。目前對于各類沙門氏菌PCR檢測方法的研究也較為多見，有只針對一種沙門氏菌的檢測方法［11-14］，也有檢測多種沙門氏菌的PCR檢測方法［15-16］，亦有同時檢測沙門氏菌和食品中其他常見菌的多重PCR檢測方法［17-19］。目前針對鼠傷寒沙門氏菌的也有所報道，但不同研究建立的各類PCR檢測方法的敏感性差異較大，而且表示方法有所不同。如陳曉玲等［20］建立的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法的敏感性為129 pg/μL。歐陽本等［21］利用該菌的mgtC和sopB基因建立了蟲重PCR檢測方法，該方法的敏感性為10 CFU/mL。榮策等［22］建立了實時熒光定質(zhì)PCR檢測方法，其敏感性為300 CFU/mL。馮飛等［23］建立的多重PCR檢測方法的敏感性為630 CFU/mL。而本實驗建立的鼠傷寒沙門氏菌ompc基因的PCR檢測方法的敏感性可達1 pg/μL，目前鮮有以ompc基因建立PCR檢測方法的相關(guān)報道。而且本實驗對PCR反應(yīng)的退火溫度、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)參數(shù)進行了優(yōu)化，進一步縮短了反應(yīng)時間，節(jié)約了成本，從而為鼠傷寒沙門氏菌的快速診斷提供了一定的參考。

［1］ KUNWAR R， SINGH H， MANGLA V， et al. Outbreak investigation：Salmonella food poisoning［J］. Medical Journal of Armed Forces India，2013， 69（4）： 388-391.

［2］ HELMS M， ETHELBERG S， MФLBAK K， et al. International Salmonella typhimurium DT104 infections， 1992—2001［J］. Emerging Infectious Diseases， 2005， 11（6）： 859-867.

［3］ 曹冬梅， 徐楊， 袁慕云， 等. 焦磷酸測序檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌［J］.微生物學雜志， 2013， 33（6）： 101-105.

［4］ 王華， 劉斌. PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報， 2010（2）： 63-67.

［5］ UYTTENDAELE M， RAJKOVIC A， CEUPPENS S， et al. PCR applications in food microbiology［J］. Encyclopedia Food Microbiology， 2014， 2： 1033-1041.

［6］ BINET R， DEER D M， UHLFELDER S J. Rapid detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli in produce enrichments by a conventional multiplex PCR assay［J］. Food Microbiology， 2014，40（6）： 48-54.

［7］ GARRIDO-MAESTU A， CHAPELA M J， VIEITES J M， et al. Application of real-time PCR to detect Listeria monocytogenes in a mussel processing industry： impact on control［J］. Food Control， 2014，46（12）： 319-323.

［8］ CHEN Xingxing， GAN Min， XU Hong， et al. Development of a rapid and sensitive quantum dot-based immunochromatographic strip by double labeling PCR products for detection of Staphylococcus aureus in food［J］. Food Control， 2014， 46（12）： 225-232.

［9］ IMANI F A A， IMAN I D， HOSSEINI D R， et al. Design of a multiplex PCR met hod for detection of toxigenic-pathogenic in vibrio cholera［J］. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine， 2013， 6（2）： 115-118.

［10］ GORDILLO R， RODR?GUEZ A， WERNING M L， et al. Quantification of viable Escherichia coli O157：H7 in meat products by duplex real-time PCR assays［J］. Meat Science， 2014， 96（2）： 964-970.

［11］ 許會會， 雷連成， 謝芳， 等. 沙門氏菌PCR檢測方法的建立［J］. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010， 37（4）： 94-97.

［12］ 陳麗萍， 劉忠民， 陳蕓， 等. 雞白痢沙門氏菌PCR檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用［J］. 畜牧獸醫(yī)雜志， 2011， 30（6）： 23-25； 27.

［13］ MALORNY B， BUNGE C， HELMUTH R， et al. A real-time PCR for the detection of Salmonella enteritidis in poultry meat and consumption eggs［J］. Journal of Microbiological Methods， 2007，70（2）： 245-251.

［14］ RANI N， VAJPAYEE P， BHATTI S， et al. Quantification of Salmonella typhi in water and sediments by molecular-beacon based qPCR［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2014， 108（10）： 58-64.

［15］ FREITAS C G D， SANTANA A P， SILVA P H C D， et al. PCR multiplex for detection of Salmonella enteritidis， Typhi and Typhimurium and occurrence in poultry meat［J］. International Journal of Food Microbiology， 2010， 139（1/2）： 15-22.

［16］ NGAN G J Y， NG L M， LIN R T P， et al. Development of a novel multiplex PCR for the detection and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi and Paratyphi A［J］. Rersearch in Microbiology， 2010， 161（4）： 243-248.

［17］ 張亮， 劉磊， 豆艷麗， 等. 濃縮蘋果汁中3 種污染菌多重PCR檢測方法的建立［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報， 2012， 47（3）： 124-128.

［18］ CHANDRA M， CHENG P， RONDEAU G， et al. A single step multiplex PCR for identification of six diarrheagenic E. coli pathotypes and Salmonella［J］. International Journal of Medical Microbiology，2013， 303（4）： 210-216.

［19］ 牟愷， 陳智， 王春民， 等. 同時檢測四種病原茵的PCR方法研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報： 自然科學版， 2010， 41（2）： 253-257.

［20］ 陳曉玲， 周玲艷， 溫仕杰， 等. 沙門氏菌PCR快速檢測技術(shù)研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學， 2009， 48（3）： 527-529.

［21］ 歐陽本， 孫振， 祁克宗， 等. 鼠傷寒沙門氏菌毒力島基因mgtC和sopB蟲重PCR檢測的研究［J］. 華北農(nóng)學報， 2013， 28（3）： 48-52.

［22］ 榮策， 趙彤彤， 許龍巖， 等. 實時熒光PCR法檢測鼠傷寒沙門氏菌［J］.食品安全質(zhì)質(zhì)檢測學報， 2012， 3（4）： 300-305.

［23］ 馮飛， 謝振文， 曾慕衡. 鼠傷寒沙門氏菌多重PCR檢測方法的研究［J］.中國生物工程雜志， 2011， 31（1）： 65-69.

Establishment of PCR Detection Method for Salmonella typhimurium Based on ompc Gene

GONG Qiang， LI Zhanli， NIU Mingfu， WANG Hui， LIU Yongkang， QIN Cuili， SUN Xiaofei
（College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

To establish a PCR detection method for Salmonella typhimurium， the ompc gene was amplified by PCR using the specific primers designed according to the sequence published in GenBank. The PCR reaction conditions were optimized based on the sensitivity and specificity of this method. The results showed that the 470 bp DNA frag ment was specifically amplified from Salmonella typhimurium and no DNA fragment was obtained from other common pathogenic bacteria in foods incl uding Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Pseu domonas aeruginosa and Shigella. The sensitivity of this PCR method was 1 pg/μL. In conclusion， this experiment can lay a foundation for further exploration of rapid detection methods for Salmonella typhimurium in foods.

Salmonel l a typhimurium； omp c gene； PCR； detection method

Q939.93

A

1002-6630（2015）16-0251-04

10.7506/spkx1002-6630-201516048

2014-11-06

河南科技大學青年科學基金項目（2012QN002）；河南科技大學SRTP項目（2014115）

宮強（1979—），男，副教授，博士，研究方向為病原微生物檢測與防治。E-mail：gongqiang79@126.com