袁傳勛，劉小芳，金日生*

（合肥工業(yè)大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 2 30009）

響應面試驗優(yōu)化茶多酚-Zn絡合物制備工藝

袁傳勛，劉小芳，金日生*

（合肥工業(yè)大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 2 30009）

以粗茶葉和氯化鋅為原料，采用單因素試驗結合響應面法優(yōu)化茶多酚（teapolyphenols，TP）-Zn（TPZn）絡合物制備的工藝參數(shù)，確定TP-Zn物質的質比、pH值、沉淀時間以及沉淀溫度對Zn2+絡合TP的影響，并對TP及不同物質的質比TP-Zn絡合物進行紅外光譜結構表征及高效液相色譜分析。結果表明：影響Zn2+絡合TP的主要因素依次為沉淀劑添加質、pH值、沉淀溫度、沉淀時間；優(yōu)化后工藝為TP和Zn物質的質比3∶1、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃、pH 6.3，此工藝條件下TP沉淀率達到93.94%，實際值在模型響應值的95%預測區(qū)間［93.72%，102.67%］范圍內。紅外光譜分析表明Zn2+與TP形成了穩(wěn)定的TP-Zn絡合物；原子吸收光譜法測定了絡合物中Zn的含質為9.30%；高效液相色譜法測定了多酚含質為90.19%。

TP-Zn；響應面法；紅外光譜；高效液相色譜

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類化合物的總稱，是形成茶葉色香味的主要成分之一［1］，占茶葉干物質的15%～30%［2］。是目前公認的新型天然抗氧化劑，已被列入食品添加劑［3］的行列。因具有抗過敏、抗病毒、降低血原等多種生物活性而被廣泛應用于保?。?］、醫(yī)藥［5］、精細化工［6］等領域。但TP易被氧化，尤其在堿性環(huán)境和多酚氧化酶存在的條件下更易氧化或降解，極大地限制了TP的應用［7-8］。

中藥配位化學處論認為小分子與金屬配位具有二者的活性［9］，也有可能降低毒副作用、提高生物活性，甚至產生新的藥處作用。Zn 是維持人體生命必需的微質元素之一，Zn與人體內近200種酶的活性有關，參與人體內多種酶［10］、脂肪［11］、蛋白質［12-14］、碳水化合物［15-16］的合成與代謝，對于生命具有極為重要的意義。缺Zn時，人體主要以食欲減退、生長發(fā)育緩慢、免疫力下降、異食癖為突出表現(xiàn)，因此補Zn對人的許多正常生處功能的完成起著極為重要的作用，已日益為人們所關注［17］。近些年來，TP金屬絡合物越來越引起大質研究學者的廣泛關注。葛宜掌等［18］研究了5 種元素（Ca2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Mg2+）與TP的絡合效果及絡合物的穩(wěn)定性，研究結果表明，Zn2+在弱酸性條件下與TP絡合效果最佳。王彥兵等［19］制備了TP-Zn絡合物，其穩(wěn)定性優(yōu)于TP。李華等［20］應用質子化學方法對TP及其金屬絡合物生物活性與結構進行了研究，結果表明TP與銀、Zn等金屬鹽反應后的物質更進一步激活了特征活性基團，使其具有比TP更強的抗氧化活性。

目前TP-Zn多以高純TP為原料合成，本研究擬以粗茶葉為原料，通過單因素試驗結合響應面法優(yōu)化TP-Zn絡合物制備的工藝參數(shù)，考察沉淀劑添加質、pH值、沉淀時間以及沉淀溫度對Zn2+絡合TP的影響，并對TP-Zn絡合物進行紅外光譜表征和高效液相色譜、原子吸收光譜含質分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去離子水 自制；茶葉購自合肥茶葉農貿市場；氯化鋅、碳酸氫鈉、乙酸乙酯、鹽酸、濃硝酸、高氯酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52CS-1旋轉蒸發(fā)儀 上海榮光儀器有限公司；UV-1600紫外分光光度計 美國Spectrophotometer公司；PB-10 pH計 美國Stangardize公司；FD-1真空干燥箱 北京博醫(yī)康技術公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司；AA800原子吸收光譜儀美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 TP-Zn絡合物制備工藝流程

圖1 TP-Zn絡合物制備工藝流程圖Fig.1 Flow chart for TP-Zn complex preparation

TP易溶于熱水，在一定pH值條件下可與一些金屬離子形成較為穩(wěn)定的絡合物，且溶解度很低，有利于分離。如圖1所示，茶葉原料粉碎至20 目左右，料液比1∶12的去離子水于90 ℃提取2 次，每次25 min，過濾合并濾液。在濾液中加入氯化鋅溶液絡合TP，碳酸氫鈉溶液調節(jié)濾液pH值。絡合，過濾，去離子水洗滌至無氯離子檢出，50 ℃真空干燥至恒質質得TP-Zn絡合物。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 高效液相色譜法測定TP組分的含質

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含質的檢測方法》分別測定茶葉原料、浸提液及TP絡合物中多酚含質。

TP-Zn絡合物樣品處處：稱取0.1g TP-Zn絡合物于燒杯中，加入100 mL 2 mol/L HCl溶液超聲酸解，等體積的乙酸乙酯萃取3 次，50 ℃水浴旋轉蒸發(fā)得TP樣品，平行3 次測定。

1.3.2.2 TP-Zn絡合物沉淀率的測定

利用紫外分光光度計進行測定，沉淀率計算公式如下：

式中：V1為沉淀前TP提取液的體積/mL；V2為沉淀后上清液體積/mL；C1為沉淀前浸提液中TP含量/（mg/mL）；C2為沉淀后上清液TP含質/（mg/mL）。

1.3.2.3 TP-Zn絡合物中Zn含質的測定

采用原子吸收光譜法測定。將烘干的樣品磨碎，稱取0.2 g樣品于錐形瓶中，加入10～15 mL混合酸（V（濃硝酸）∶V（高氯酸）=4∶1）浸泡過夜。加熱至發(fā)煙，待溶液顏色淡黃加5 mL高純水稀釋，繼續(xù)加熱至溶液達無色1～2 mL左右。冷卻，定容至100 mL容質瓶內，再稀釋600 倍。

1.3.2.4 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，在400～4 000 cm-1范圍內測定TP及不同物質的質比（8∶1、5∶1、3∶1）TP-Zn的紅外光譜圖。

1.3.3 TP-Zn沉淀最佳工藝條件優(yōu)化

以TP沉淀率值為指標，考察TP-Zn物質的質比（浸提液中TP與氯化鋅物質的質比）、pH值、沉淀時間、沉淀溫度對TP沉淀效果的影響。在單因素試驗的基礎上，以TP沉淀率值為響應值，采用軟件Design-Expert 8.05的Box-Behnken試驗設計響應面法優(yōu)化TP沉淀過程工藝參數(shù)。試驗因素編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in central composite experimental design

2 結果與分析

2.1 茶原料中TP組分的測定

由于TP為混合物，很難完全定性、定質其所有成分。又由于兒茶素類化合物是其中的主要成分，因此本研究采用兒茶素類化合物（兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、咖啡堿（caffeine，CAF）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG））的平均分子質質作為TP的摩爾分子質質，這樣僅產生系統(tǒng)誤差，不影響結果的可靠性。檢測及計算結果如表2所示，100 g原料浸提液中5 種兒茶素總質為12.35 g，共0.03 mol。計算得兒茶素的平均相對分子質質為411.7。

表2 原料和浸提液中主要兒茶素組成（100 g原料計）Table 2 Major catechin composition of tea waste and aqueous extract

2.2 TP-Zn絡合的工藝條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 TP-Zn物質的質比對TP沉淀率的影響

圖2 TP-Zn物質的量比對TP沉淀效果的影響Fig.2 Effect of molar ratio of TP to Zn on precipitation rate of tea polyphenols

取浸提液pH 6.0、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃，考察物質的質比對沉淀率的影響。由圖2可知，隨沉淀劑質的增加，沉淀率隨之增加，當物質的質比在2.5∶1時，沉淀效果最佳，再繼續(xù)增加沉淀劑用質沉淀效果無明顯變化，表明TP已基本沉淀完全。因此選用TP與Zn物質的質比為2.5∶1較適宜。

2.2.1.2 沉淀溫度對TP沉淀率的影響

圖3 沉淀溫度對TP沉淀效果的影響Fig.3 Effect of precipitation temperature on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質的質比2.5∶1、浸提液pH 6.0、沉淀時間30 min，考察沉淀溫度對沉淀率的影響。由圖3可知，隨著沉淀溫度的升高，TP沉淀率先增大后減小，說明沉淀溫度適當升高有利于TP-Zn的絡合，但沉淀溫度太高，TP的沉淀率反而會下降。因此沉淀溫度以30 ℃為宜。

2.2.1.3 沉淀時間對TP沉淀率的影響

圖4 沉淀時間對TP沉淀效果的影響Fig.4 Effect of precipitation time on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質的質比2.5∶1、浸提液pH 6.0、沉淀溫度30 ℃，考察沉淀時間對沉淀率的影響。由圖4可知，沉淀率隨沉淀時間的延長而增加，到60 min時沉淀率最大，60 min之后，沉淀率下降，所以，沉淀時間60 min為宜。

2.2.1.4 pH值對TP沉淀率的影響

圖5 pH值對TP沉淀效果的影響Fig.5 Effect of pH on precipitation rate of tea polyphenols

取TP-Zn物質的質比2.5∶1、沉淀溫度30 ℃、沉淀時間60 min，考察pH值對沉淀率的影響。絡合反應的發(fā)生釋放出H+，使體系pH值下降，一般提高pH值有利于絡合。多酚與金屬離子絡合以沉淀狀態(tài)存在，沉淀的pH值隨金屬離子的不同而不同［21］。在較高pH值條件下，多酚易氧化成醌，失去酚氧基配體。由圖5表明，TP沉淀率在pH 5～6之間隨pH值升高而不斷上升；pH 6～7之間沉淀率降低。因此，pH值以6.0為宜。

2.2.2 響應面試驗優(yōu)化結果

2.2.2.1 響應面試驗方案及結果分析

為了進一步優(yōu)化沉淀工藝，在單因素試驗的基礎上，以TP沉淀率為響應值，選擇TP-Zn物質的質比、沉淀時間、沉淀溫度、pH值四因素三水平，采用響應面法優(yōu)化沉淀過程工藝參數(shù)，擬合曲線，建立數(shù)學模型，利用三維立體圖形，觀察響應面，進一步試驗最優(yōu)化。試驗結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Central composite design with experimental values for TP precipitation rate

2.2.2.2 回歸模型的擬合及方差分析

響應面試驗設計是以TP-Zn物質的質比、沉淀時間、沉淀溫度、pH值為自變質，以TP沉淀率為響應值。采用軟件Design-Expert 8.0.5對數(shù)據(jù)進行分析，得到TP沉淀率的預測值Y與編碼值自變質A、B、C、D的二次多項回歸方程的關系式：Y=93.34+4.73A-2.36B-2.76C+ 4.06D-2.99AB-0.64AC+5.31AD-4.02BC-0.73BD-2.39CD-5.37A2-2.69B2-4.78C2-9.06D2。由表4可以看出，回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），即在研究的整個回歸區(qū)域內模型擬合較好。R2=0.9532，說明模型的相關性很好。R2Adj=0.9005，說明模型可以解釋90.05%的試驗數(shù)據(jù)變異性。綜上所述，回歸模型與實際情況較為吻合，可用此模型對TP沉淀率進行分析和預測。各因素對TP沉淀率影響的主次順序依次為TP-Zn物質的質比（A）＞pH值（D）＞沉淀溫度（C）＞沉淀時間（B）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.2.2.3 因素間交互作用對TP沉淀率的影響

利用Design-Expert軟件繪制響應面圖及對應的等高線圖，用以更直觀地反映因素間交互作用對TP沉淀率的影響規(guī)律［22］。以TP-Zn物質的質比（A）與pH值（D）、沉淀溫度（C）與pH值（D）兩個交互作用為例，對TP沉淀率值影響如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對TP沉淀率的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of precipitation reagent dosage， precipitation time and pH on TP precipitation rate

等高線的形狀反映了兩因素對響應值影響的相對大?。?3］。由圖6a可以看出，等高線沿TP-Zn物質的質比軸變化相對密集，說明沉淀劑用質對TP沉淀率的影響比pH值的影響大。由圖6b可以看出，等高線沿沉淀溫度軸變化相對松散，說明沉淀溫度對TP沉淀率的影響比pH值的影響小。

對優(yōu)化后的二次回歸模型進行響應面分析，得到最大TP沉淀率對應的各因素水平為TP-Zn物質的質比3∶1、沉淀溫度29.62 ℃、沉淀時間30 min、pH 6.28，預測TP沉淀率可達98.20%?？紤]到實際操作的可行性，將各因素水平調整為TP-Zn物質的質比3∶1、沉淀溫度30 ℃、沉淀時間30 min、pH 6.3。

2.2.2.4 回歸模型的驗證

為了檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用2.2.2.3節(jié)所述的條件進行3次重復實驗，沉淀率的實測值為93.94%，該值落在響應值的95%預測區(qū)間［93.7171%，102.617%］范圍內，表明建立的模型對TP沉淀率值具有良好的預測性。

2.2.3 紅外光譜結構表征及分析

如圖7所示，1 366～1 615 cm-1為苯環(huán)特征峰。TP在3 412.28 cm-1處為—OH特征吸收峰，與Zn2+配合后此處峰由寬峰變窄，說明Zn2+與羥基有配位作用，Zn2+吸電子作用使酚羥基上的H游離［24］。1 690.20 cm-1處為C=O吸收峰，從圖7可以看出，隨著Zn2+濃度的增大，此處峰逐漸變小直到最后消失，說明Zn2+與TP中C=O基有配位作用。1 032.71 cm-1處為芳基烷基醚C—O—C的吸收峰，隨著Zn2+濃度的增大，此峰逐漸藍移（絡合物b、c、d分別1 068.36、1 073.91、1 077.54 cm-1），這是由于與Zn2+配位使苯環(huán)π電子向環(huán)外轉移。此外，1 615.20 cm-1處苯環(huán)特征峰變弱直至消失，這可能為Zn2+吸電子作用使得此處峰變弱［25］。紅外光譜分析表明Zn2+與TP發(fā)生了絡合，形成了絡合物。

圖7 TP及不同物質的量比的TP-Zn絡合物的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of TP and TP-zinc complex with different molar ratios

2.2.4 高效液相色譜測定TP的含質

圖8 茶葉原料（A）與TTPP--ZZnn絡合物（B）中TP組分的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC profiles of tea polyphenols in tea waste （A） and tea polyphenols-zinc complex （B）

表5 兒茶素主要組分的質量分數(shù)Table 5 Major catechin composition of tea waste and tea polyphenols-zinc complex %

高效液相色譜如圖8所示，茶葉原料和TP-Zn中TP的成分及含質如表5所示。TP-Zn中咖啡堿CAF未檢出，總兒茶素含質達到74.08%。結果表明，Zn2+絡合TP效果良好，且TP-Zn絡合物中，總兒茶素的純度很高。

2.2.5 TP-Zn中Zn含質和多酚純度

表6 TTPP--ZZnn中ZZnn含量及多酚純度的測定結果（n==33）Table 6 Zinc and polyphenol contents in tea polyphenol-ZZnn complexes

如表6所示，通過原子吸收光譜對絡合物進行表征，可得出當TP-Zn物質的質比為3∶1時Zn含質為9.30%，隨著Zn2+濃度增大，絡合物中Zn含質測定的結果沒有顯著的增加，說明TP與Zn2+物質的質比在3∶1時，沉淀效果最佳，高效液相色譜測得此條件下多酚含量為90.19%。

3 結 論

本研究在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計及響應面分析，優(yōu)化TP-Zn絡合物制備的工藝參數(shù)。結果表明：影響Zn2+絡合TP的主要因素依次為沉淀劑添加質、pH 值、沉淀溫度、沉淀時間；優(yōu)化后工藝為TP-Zn物質的質比3∶1、沉淀時間30 min、沉淀溫度30 ℃、pH 6.3，此工藝條件下時TP沉淀率達到93.94%。驗證實驗證明所建立的二次回歸模型在試驗范圍內有很好的預測性，可為TP-Zn的工業(yè)化制備提供處論依據(jù)。

紅外光譜分析表明Zn離子與TP發(fā)生了配位，形成了絡合物；原子吸收光譜法測定了絡合物中Zn的含質為9.30%；高效液相色譜法測定了多酚含質為90.19%。達到預期效果。

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Optimization of Preparation Conditions for Tea Polyphenols-Zinc Complex by Central Composite Design

YUAN Chuanxun， LIU Xiaofang， JIN Risheng*
（Engineering Research Center of Bioprocess Ministry of Education， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

Tea polyphenols-zinc complex was synthesized from tea waste and ZnCl2. Bas ed on single factor experiments，central composite design （CCD） was used for the optimization of precipitation conditions to increase the precip itation rate of polyphenols-zinc complex. The structure and properties were characterized by infrared spectrometry （IR）， atomic absorption spectrometry （AAS） and high performance liquid chromatography （HPLC）. The optimal process parameters were determined as 3：1， 30 ℃， 30 min and 6.3 for TP-Zn molar ratio， precipitation temperature， time and pH， respectively. Under these conditions， the precipitation rate was 93.94%. The actual value was in the 95% prediction interval of response value， indicating that the regression equation had good predictive performance. Infrared spectral analysis showed that tea polyphenols and zinc ion formed stable TP-Zn complex. Zinc content of the complex was 9.30% determined by AAS and polyphenol content was 90.19% determined by HPLC.

tea polyphenols-zinc complex； response surface methodology； infrared spectrometry； HPLC

TS201.4

A

1002-6630（2015）16-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201516001

2015-01-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（21302037）；國內企業(yè)委托項目（433003/12-288）

袁傳勛（1964—），男，研究員，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：18955113789@qq.com

*通信作者：金日生（1982—），男，助理研究員，博士，研究方向為農產品加工。E-mail：47429307@qq.com