張慧，吳環(huán)，黃偉乾，劉冬虹，冼燕萍，郭新東，葉梅，萬(wàn)渝平

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州510110；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610000）

微生物法快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量

張慧1，吳環(huán)1，黃偉乾1，劉冬虹1，冼燕萍1，郭新東1，葉梅2，萬(wàn)渝平2

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州510110；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610000）

建立了一種高效快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。方法通過(guò)改進(jìn)試驗(yàn)用菌的保存和傳代，優(yōu)化樣液制備和加樣體積，結(jié)合八道排槍同時(shí)加樣操作和96孔酶標(biāo)板技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，減少了試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)誤差。結(jié)果表明，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.9992，檢出限為2μg/100g，樣品平行試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在7.5%～9.5%之間，加標(biāo)回收率在93.3%～105%之間，檢測(cè)周期縮短為2 d。與國(guó)標(biāo)方法等相比較，本方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可準(zhǔn)確快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量。

葉酸；微生物法；快速檢測(cè)

葉酸（Folic acid）屬于B族維生素，1941年被分離提純并定名為葉酸[1]。葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特征相近的化合物的統(tǒng)稱(chēng)，由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸與1個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成[2]。葉酸是維持人體生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝的重要水溶性維生素。有研究表明，人群中葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致胎兒先天性異常，特別是神經(jīng)管畸形的發(fā)生[3]；也會(huì)引起細(xì)胞性貧血和粒細(xì)胞減少，尤其對(duì)于處于生長(zhǎng)發(fā)育旺盛期的嬰幼兒，如果缺少足夠的葉酸，生長(zhǎng)就會(huì)受到嚴(yán)重影響[4]。嬰幼兒配方乳粉是以嬰幼兒生長(zhǎng)時(shí)期的特殊營(yíng)養(yǎng)需要而設(shè)計(jì)的產(chǎn)品，對(duì)于強(qiáng)化維生素的含量有嚴(yán)格要求；嬰幼兒配方乳粉中葉酸的含量十分微量，一般在20μg/100 g～200μg/100 g之間。因此，快速準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸的含量具有重要的意義。

目前測(cè)定葉酸的方法有比色法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、微生物法和同位素放射免疫法[5-7]等。測(cè)定原料葉酸、純?nèi)~酸制品或藥品制劑中的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般采用比色法；而生物體、食品中葉酸的測(cè)定多采用微生物法、同位素放射免疫法或色譜法、色-質(zhì)聯(lián)用法[8]。嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的測(cè)定可以采用微生物法和儀器法，但可能因奶粉基質(zhì)干擾的影響，儀器法的靈敏度和回收率都比微生物法低，微生物法的實(shí)際應(yīng)用更為普遍。在第18版的AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法中，食物中生物素、泛酸、葉酸、VB12和煙酸的第一分析方法均為微生物法；我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于嬰幼兒食品和乳品中葉酸含量的測(cè)定，微生物法是唯一的測(cè)定方法，其測(cè)定原理為：應(yīng)用對(duì)葉酸具有極強(qiáng)特異性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）菌種，一定條件下該菌種的生長(zhǎng)繁殖速度與溶液中葉酸的含量成一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)[8-9]。本試驗(yàn)在傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和商業(yè)化的試劑盒法的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)試驗(yàn)用菌的保存和傳代，優(yōu)化樣品溶液的制備，結(jié)合八道排槍同時(shí)加樣操作和96孔酶標(biāo)板技術(shù)，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟、縮短了檢測(cè)周期、減少了殘留維生素帶來(lái)的污染，建立了快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，產(chǎn)地：美國(guó)）；培養(yǎng)基：乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，均為BD（碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，產(chǎn)地：美國(guó)）；標(biāo)準(zhǔn)品：葉酸（99.9%）（USP，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，產(chǎn)地：美國(guó)）；抗壞血酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），配制葉酸酪蛋白培養(yǎng)基時(shí)加入0.05%抗壞血酸鈉；1.2mLPP管（美國(guó)Corning公司）；1.2mL凍存管（美國(guó)Corning公司）。

試驗(yàn)樣品：Standard ReferenceMaterial1849a（SRM 1849a）（National Institute of Standards and Technology，產(chǎn)地：美國(guó)，奶粉基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，葉酸含量229.3± 6.2 ug/100 g）、市售嬰幼兒配方乳粉和市售孕婦奶粉。

儀器：TransferpetteRS-8八道排槍?zhuān)ǖ聡?guó)BRAND）；HVE-50高壓滅菌鍋（日本平山公司）；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；680酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；通Z323K用型高速離心機(jī)（德國(guó)HERMLELabortechnik GmbH公司）；VORTEX 4 basic渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的制備與保存

將干酪乳桿菌干粉接種到已滅菌乳酸桿菌肉湯，（36±1）℃培養(yǎng)2 h～24 h。將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物3 000 r/min離心10min，棄去肉湯培養(yǎng)基，加入無(wú)菌水如此清洗3次后得到不含有培養(yǎng)基的菌液，吸取一定體積的此菌液加入到已滅菌的含有甘油和抗壞血酸鈉的葉酸酪蛋白測(cè)定培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠁挝患s為2.0，加入凍存管中，制備成試驗(yàn)用菌懸液，-80℃超低溫凍存。每次試驗(yàn)時(shí)取出后即可使用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的制備

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為0.60 ng/mL，在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾備用。

在無(wú)菌條件下，按表1順序在滅菌小管中對(duì)葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋?zhuān)苽湎鄳?yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。

表1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的制備Table 1 Thepreparation of folic acid standard curvesolution

在已滅菌的PP管中每管加入300μL系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和300μL含有0.05%濃度試驗(yàn)用菌懸液的無(wú)菌葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，一式3份，使用渦旋振蕩器混合。

1.2.3 樣品測(cè)定液的制備

稱(chēng)取5 g樣品，作20倍稀釋?zhuān)?5℃水浴30min，充分溶解后制得待測(cè)樣品溶液。將待測(cè)樣品溶液在無(wú)菌條件下使用無(wú)菌濾器過(guò)濾，根據(jù)樣品標(biāo)示葉酸的含量進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)玫綐悠饭ぷ饕骸?/p>

在無(wú)菌條件下，按表2順序在滅菌小管中對(duì)樣品工作液進(jìn)行稀釋?zhuān)苽湎鄳?yīng)濃度的樣品測(cè)定溶液。

表2 樣品測(cè)定液的制備Table 2 The preparation of sam p le determ ination solution

在已滅菌的PP管中每管加入300μL系列樣品測(cè)定溶液和300μL含有0.05%濃度試驗(yàn)用菌懸液的無(wú)菌葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，一式3份，使用渦旋振蕩器混合。

1.2.4 培養(yǎng)

使用96孔試驗(yàn)盒，將已滅菌的PP管插入試驗(yàn)盒，每列8根管，使用八道排槍按1.2.2和1.2.3加樣后（36±1.0）℃培養(yǎng)24 h～28 h。

1.2.5 測(cè)定

混合均勻，使用酶標(biāo)儀630 nm波長(zhǎng)進(jìn)行讀數(shù)。平行小管相對(duì)偏差小于15%的為有效數(shù)值。

1.2.6 樣品葉酸含量的計(jì)算

根據(jù)樣品每管的吸光值從葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得對(duì)應(yīng)的葉酸含量，除以相對(duì)樣液體積v，得到每管樣品溶液中葉酸含量。由所有有效管中測(cè)得的數(shù)值計(jì)算平均值。樣品中葉酸含量按下列公式計(jì)算：X/（μg/100 g）=×100，式中：m為樣品質(zhì)量，（g）；f為樣品稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種制備與保存方法的改進(jìn)

傳統(tǒng)的微生物法常存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣等問(wèn)題。GB 5413.16-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定》是傳統(tǒng)的微生物法，實(shí)驗(yàn)用菌株的保存與傳代，每月都要轉(zhuǎn)接一次作為月接種管，每次試驗(yàn)前要從月接種管轉(zhuǎn)接一次作為日接種管，試驗(yàn)時(shí)日接種管都要進(jìn)行菌種的洗滌去除凍存培養(yǎng)基，然后制備成試驗(yàn)用菌液，這樣每次試驗(yàn)的耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁瑣，菌種制備需要2 d，試驗(yàn)操作1 d，培養(yǎng)1 d～1.5 d，整個(gè)檢測(cè)周期耗時(shí)4 d～4.5 d。

本試驗(yàn)方法中，試驗(yàn)用菌懸液預(yù)先于-80℃超低溫凍存在含有甘油和抗壞血酸鈉凍存管中，其中甘油作為防凍劑防止冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害，有效保護(hù)了菌種[10]。每次試驗(yàn)時(shí)只需要拿出一支添加到培養(yǎng)基中，不僅可以保證菌種被混勻到培養(yǎng)基中，也簡(jiǎn)化了操作步驟；而凍存管中的抗壞血酸鈉在培養(yǎng)和檢測(cè)中也起到了一定的防止葉酸被氧化的作用。在整個(gè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)操作1 d，培養(yǎng)1 d，僅需2 d就可以完成檢測(cè)，大大縮減了檢測(cè)周期，提高了工作效率。

2.2 樣液制備和測(cè)定方法的優(yōu)化

GB 5413.16-2010方法中，樣品溶液制備需要經(jīng)過(guò)多步稀釋?zhuān)褂昧舜罅啃韪邷販缇牟Ａ髅螅罱K培養(yǎng)的試驗(yàn)體積需要10mL，總體積較大，造成試驗(yàn)操作耗時(shí)，而且操作過(guò)程中容易存在微量維生素污染的問(wèn)題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。本試驗(yàn)方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品測(cè)定液的制備均使用一次性滅菌的1.2mLPP管，在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，最終培養(yǎng)的試驗(yàn)體積只需要600μL（樣品測(cè)定溶液和培養(yǎng)基各為300μL），由于添加體積的縮小，可以使用八道排槍進(jìn)行操作，不僅操作簡(jiǎn)便，而且保證了每個(gè)PP管中的添加量一致，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度；同時(shí)，一次性滅菌PP管的使用，避免了殘留維生素的污染。

德國(guó)拜發(fā)公司推出VitaFastR維生素檢測(cè)試劑盒，試驗(yàn)原理與國(guó)標(biāo)相同，它將96孔酶標(biāo)板和酶標(biāo)儀引入到試驗(yàn)中，以ELISA微孔板方法為形式和載體，進(jìn)行維生素的測(cè)定，這種商業(yè)化的試劑盒法操作簡(jiǎn)便，大大縮短檢測(cè)時(shí)間[11-12]，但其配套標(biāo)準(zhǔn)溶液的保藏是影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，如果樣品溶液只做一個(gè)稀釋度的檢測(cè)，會(huì)極大地影響檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，而且價(jià)格昂貴。本試驗(yàn)方法中，在改進(jìn)菌種制備和保存、樣品溶液制備方法的基礎(chǔ)上，引入96孔酶標(biāo)板技術(shù)，進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率，而且降低了試驗(yàn)成本。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與方法的檢出限

以表1的系列葉酸濃度做為橫坐標(biāo)，以吸光度值做為縱坐標(biāo)，根據(jù)四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Folic acid standard curve

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 2，表明相關(guān)性良好。根據(jù)樣品的處理和回收率情況，計(jì)算本方法的檢出限為2μg/100 g，表明方法靈敏度高。

2.4 方法回收率和重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.1 加標(biāo)回收試驗(yàn)

配制葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 000 ng/mL，以SRM 1849a為試驗(yàn)樣品，分別稱(chēng)取4次5 g試驗(yàn)樣品，各加入0、0.5、1.0、2.0m L葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，即加標(biāo)量分別為0、5 000、10 000、20 000 ng，然后分別定容至100mL，按步驟1.2進(jìn)行試驗(yàn)，分別做3次重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，回收率為93.3%～105.0%，表明方法回收率高。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab le3 Theadd ition standard recovery test's result

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

分別對(duì)SRM 1849a和6種不同的配方奶粉進(jìn)行檢測(cè)，每種樣品做6次平行對(duì)照。結(jié)果顯示，SRM 1849a的RSD值為7.4%，6種奶粉6次平行試驗(yàn)的RSD在7.5%～9.5%之間（表4），說(shuō)明本方法的重現(xiàn)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Repetitive test’s result

2.5 方法的比較

根據(jù)2.1和2.2所述，相比GB 5413.16-2010，本方法具有檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確靈敏等特點(diǎn)；相比商業(yè)化試劑盒方法，本方法具有檢測(cè)成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

試驗(yàn)進(jìn)一步比較了采用反相離子對(duì)色譜法和本方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，見(jiàn)表5。

表5 反相離子對(duì)色譜法與本方法的比較Table 5 The com parison of reversed phase ion pair chromatography andm icrobiologicalm ethod

其中反相離子對(duì)色譜法的前處理?xiàng)l件參照GB 5413.16-2010（稱(chēng)取樣品10g，加磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，臨用前按1.0 g/100m L加入抗壞血酸，再用氫氧化鈉調(diào)到pH7.0）70mL溶解，置于121℃滅菌15min，冷卻后滴加幾滴（1+1）鹽酸溶液使蛋白沉淀，再定容至100mL，過(guò)濾后，濾液待測(cè)），色譜條件參照GB/T17813-1999《復(fù)合預(yù)混料中煙酸、葉酸的測(cè)定高效液相色譜法》，方法檢出限為60μg/kg（即6μg/100 g）。反相離子對(duì)色譜法的樣品加標(biāo)量為16.46μg，本方法的樣品加標(biāo)量為5 000 ng。由表5可見(jiàn)，反相離子對(duì)色譜法的回收率在80%左右，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出樣品中葉酸含量不同，其回收率差異較大，葉酸含量越大，回收率越高；而本方法的回收率在98%左右，不同葉酸含量樣品的回收率相差不大，回收穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和商業(yè)化的試劑盒法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的優(yōu)化，將試驗(yàn)用菌懸液預(yù)先超低溫凍存在含有甘油的凍存管中，同時(shí)采用八道排槍進(jìn)行加樣，減少了試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)誤差；將96孔酶標(biāo)板試驗(yàn)原理引用到微生物法中，采用酶標(biāo)儀微孔板方式對(duì)維生素進(jìn)行讀數(shù)[13]，建立了快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物法。與國(guó)標(biāo)等其它方法相比較，本方法具有檢測(cè)周期短、操作步驟簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性高和節(jié)約檢測(cè)成本等優(yōu)勢(shì)，適合在常規(guī)試驗(yàn)室進(jìn)行推廣應(yīng)用。

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Rapid M icrobiologicalM ethods Detecting the Content of Folic Acid in Infant Formula M ilk Powder

ZHANGHui1，WUHuan1，HUANGWei-qian1，LIUDong-hong1，XIANYan-ping1，GUOXin-dong1，YEMei2，WANYu-ping2
（1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，Guangdong，China；2.Chengdu Food and Drug Inspection Institute，Chengdu 610000，Sichuan，China）

A simpleand rapidmethod wasestablished based onmicrobiologicalmethods to determine folic acid in infant formula milk powder.The experimental procedures and test errors were reduced through improved preservation and passage of bacteria，optimization of sample preparation and sample volume with the eight volley and 96-wellmicroplate.Under the optimal conditions，the correlation coefficient of standard curvewas 0.9992，detection limitwas2μg/100 g，the relative standard deviation （RSD）of sample parallel assaywere between 7.5%-9.5%，Themean recoveries for infant formulamilk powderwere between 93.3%-105%，and test cycle was reduced to 2 days.Themethods compared with national standard method were simple，rapid，sensitive and reproducible characteristics so that the content of folic acid in infant formulamilk powder was accurately and rapidly tested.

Folic acid；microbiologicalmethod；Rapid test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.017

2015-03-02

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目（2013CS01）

張慧（1985—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品微生物檢驗(yàn)。