孟閃閃，蔡文萍，馬紀

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荒漠甲蟲小胸鱉甲抗凍蛋白的酵母表達及應用

孟閃閃，蔡文萍，馬紀

新疆大學生命科學與技術學院新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046

孟閃閃, 蔡文萍, 馬紀. 荒漠甲蟲小胸鱉甲抗凍蛋白的酵母表達及應用. 生物工程學報, 2015, 31(8): 1255–1265.Meng SS, Cai WP, Ma J. Yeast expression and application of an antifreeze protein from the desert beetle Microdera punctipennis. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1255–1265.

昆蟲抗凍蛋白(Antifreeze protein，AFP) 的抗凍活性很高，可應用于生物組織和細胞的低溫保存。為了在酵母中表達荒漠甲蟲小胸鱉甲抗凍蛋白MpAFP698，并確定其在低溫下的保護作用，本文通過構建真核表達載體pPIC9K-，轉化巴斯德畢赤酵母GS115，誘導表達小胸鱉甲抗凍蛋白MpAFP698。利用免疫印跡 (Western blotting) 分析MpAFP698蛋白的特異性表達，結果顯示基因可整合到酵母基因組中并分泌表達，且酵母自身蛋白很少分泌表達。檢測抗凍蛋白的低溫保護作用，結果發(fā)現，小胸鱉甲抗凍蛋白可顯著改善冷凍小鼠肝臟等器官的細胞形態(tài)，降低血細胞在4 ℃的溶血率，提高SF9細胞凍融后的存活率。本研究表明，小胸鱉甲AFP可以在畢赤酵母中分泌表達，便于純化，有良好的低溫保護效果。

抗凍蛋白，低溫保存，應用，巴斯德畢赤酵母，血細胞

抗凍蛋白 (Antifreeze protein，AFP) 是一類廣泛存在于魚類、植物、真菌、昆蟲等變溫生物中的蛋白質[1-2]，具有來源、類型、結構和活性的多樣性[3]。抗凍蛋白的主要功能是熱滯效應 (Thermal hysteresis activity, THA)，即降低溶液的冰點，但不改變其熔點，從而產生冰點與熔點之間的溫度差值。這種熱滯值越大，抗凍蛋白的活性就越高[4]，因而AFP亦稱為熱滯蛋白 (Thermal hysteresis protein, THP)?？箖龅鞍卓梢砸种票L，并改變冰晶形態(tài)；植物和魚類抗凍蛋白還具有重結晶抑制效應 (Recrystallization inhibition, RI)[5]。昆蟲抗凍蛋白具有十分獨特的b-螺旋結構，由數目不等的保守基序TCTxSxxCxxAx (X代表任意氨基酸) 組成，分子內部可形成眾多二硫鍵[6]。在所有抗凍蛋白中，昆蟲抗凍蛋白具有很高的熱滯活性，黃粉蟲抗凍蛋白濃度為1 mg/mL時的熱滯活性可達5.5 ℃，為魚類抗凍蛋白熱滯活性的10?100倍[7-8]。因此昆蟲抗凍蛋白可能具有更高的應用價值。

抗凍蛋白可用于細胞、組織和器官的超低溫保存[9-10]，使冷藏和冷凍食品保持質地柔軟，減少滴液以防止營養(yǎng)成分的損失[11-13]。魚類AFP添加于冰淇淋和牛奶中，可消除冰渣，改善質量和口味[14]。目前，昆蟲抗凍蛋白已在原核生物中成功表達，趙干等[15]克隆并利用大腸桿菌表達了小胸鱉甲融合抗凍蛋白，該蛋白對細菌具有顯著的抗凍保護作用。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有時間短、成本相對較低的優(yōu)勢，但由于目的蛋白常以包涵體形式表達，影響產物的活性[16]。Leinala等[17]在大腸桿菌中表達了云杉卷葉蛾抗凍蛋白，但都是無活性的包涵體，需經變性復性處理，得到部分有活性的蛋白。Loewen等[18]用酵母菌表達美絨杜父魚II型AFP，經過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，可使l0 L發(fā)酵罐的產量達30 mg/L。Li等[19]用分泌載體pGAP ZaA在巴斯德畢赤酵母的蛋白水解酶缺陷型SMDl168H體內表達大西洋鯡魚的Ⅱ型AFP，該蛋白具有抗凍功能，酵母細胞在低溫下的存活率得以提高。趙干等[20]利用pGAPZαA真核表達載體在SMD1168中表達了有活性的小胸鱉甲抗凍蛋白。由于SMD1168為蛋白酶缺失型菌株，生長緩慢，導致外源蛋白的產量不高[21]。另外，pGAPZαA表達載體以Zeocin為選擇性標記，而Zeocin是一種強誘變劑，可能導致轉化子發(fā)生突變。從應用的角度考慮，需要建立一個更為可行的表達系統(tǒng)。

本研究選用pPIC9K作為酵母整合載體，該載體在多克隆位點前含有信號肽編碼序列，使表達的蛋白分泌到胞外，而酵母自身分泌的蛋白很少[22-23]，便于目的蛋白的純化與濃縮。pPIC9K含組氨酸脫氧酶基因 (HIS4)，在轉化菌株中作為篩選標志，含有抗G418 (Kanamycin) 的基因，可通過提高G418的濃度，簡便快速地篩選高拷貝的轉化子。本研究所采用的抗凍蛋白MpAFP698源自新疆荒漠昆蟲小胸鱉甲[15]，通過原核表達質粒pGEX-4T-1-，獲取目的基因，構建真核表達載體pPIC9K-，電轉化畢赤酵母，并將導入酵母GS115基因組中，篩選高拷貝轉化子，以期提高抗凍蛋白的表達量，為昆蟲抗凍蛋白的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒及實驗動物

大腸桿菌菌株，pGEX-4T-1-質粒，pPIC9K質粒，宿主菌GS115均為本實驗室保存。昆明白小鼠購自新疆醫(yī)科大學動物中心。

1.1.2 工具酶及其他試劑

超純水，氨卞青霉素 (Amp)、G418抗生素，限制性內切酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和pMD18-T載體均購自大連TaKaRa公司；DNA相對分子質量標準物、蛋白質相對分子質量標準物和DNA片段回收試劑盒購自北京天根生物工程公司；YPD固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基及其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達載體的構建與鑒定

利用本實驗室構建的原核表達質粒pGEX-4T-1-M，獲取小胸鱉甲的抗凍蛋白基因(GenBank Accession No. AY821792)。用限制性內切酶Ⅰ和RⅠ雙酶切pGEX-4T-1-，經0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收基因片段；將質粒pPIC9K同樣用Ⅰ和RⅠ雙酶切，回收pPIC9K載體片段，用T4 DNA連接酶在16 ℃過夜連接pPIC9K載體與基因片段，獲得重組質粒pPIC9K-(圖1)。連接產物轉化TOP10感受態(tài)細胞，涂布于LB平板上 (含1‰氨芐青霉素)，篩選重組子。堿裂解法小量提取重組質粒pPIC9K-，并用限制性內切酶RⅠ和Ⅰ進行酶切鑒定。鑒定正確的重組質粒用限制性內切酶Ⅰ線性化，用電轉儀 (2.0 kV，5?10 ms) 轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，并涂布于G418抗性選擇YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2?4 d后，挑取抗G418的陽性克隆，提取酵母基因組DNA。載體上攜帶有醇氧化酶基因 (AOX1)，用3′AOX1引物和5′AOX1引物 (表1) 進行PCR擴增，鑒定轉化菌。以空載體pPIC9K同樣轉化酵母菌，作為對照。

表1 質粒鑒定所用的引物序列

圖1 pPIC9K-Mpafp698重組質粒示意圖

1.2.2 重組酵母菌MpAFP698的誘導表達

在無菌條件下將重組轉化的酵母菌單克隆接種到25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng) (250 r/min) 至600達到4.0?6.0 (大約16?18 h)。室溫條件下4 500 r/min離心5 min后收獲菌體，用BMMY培養(yǎng)基稀釋菌體至600=1.0。在1 L的三角瓶中培養(yǎng)，在30 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)菌液 (250 r/min) 。每隔24 h補加100％甲醇至終濃度0.5%，培養(yǎng)至96 h時終止誘導。三氯乙酸 (TCA) 法濃縮純化酵母表達的MpAFP698。對空載體pPIC9K轉化菌也進行同樣的誘導表達。

1.2.3 MpAFP698的Tricine SDS-PAGE和Western blotting分析

取發(fā)酵上清濃縮液加入6×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清進行Tricine SDS-PAGE檢測，以等量空載體轉化菌的誘導后上清液做相同處理作為對照組。電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上。用1%脫脂奶粉封閉2 h，依次滴加一抗稀釋液 (室溫反應2 h、PBS洗滌3次) 及羊抗兔IgG：HRP (室溫反應1 h、PBS洗滌3次)，最后加底物DAB顯色并拍照。一抗為小胸鱉甲抗凍蛋白的特異性兔抗血清，由本實驗室制備。

1.2.4 MpAFP698抗凍蛋白熱滯活性的測定

使用滲透壓儀 (Automatic Osmometer，Model 5004，北京迪索公司) 測量溶液的滲透濃度，單位為毫滲 (mOsm)?1 mOsm相當于 1 mmol/L溶質溶于1 kg水中，而1 Osm/kg的溶質會使溶液的冰點下降1.858 ℃。所以，將滲透濃度乘以–1.858可估算樣品的冰點值。因此，熱滯活性 (THA) 的近似計算方法為：–1.858× (對照溶液的滲透濃度?抗凍蛋白溶液的滲透濃度) mOsm/1 000。選取不同濃度的抗凍蛋白，每組設3個重復。

1.2.5 MpAFP698對SF9細胞低溫保存的影響

選取昆蟲卵巢細胞SF9為實驗材料。收集對數生長期的細胞，在培養(yǎng)液中分別加入：BSA (陰性對照)、10%DMSO、MpAFP，另設一組只有培養(yǎng)液的空白對照。細胞的最終密度為5×106/mL–1×107/mL，將細胞分裝入凍存管中，放入?20 ℃冰箱2 h，然后放入?70 ℃冰箱過夜，之后移入液氮容器內。細胞在37 ℃溫水中復蘇后，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，用尼康光學顯微鏡 (Nikon, Japan) 觀察細胞形態(tài) (10×20倍)，用細胞計數板計數。同時，使用電導儀 (雷磁，DDS-307A，上海) 測定細胞電導率，單位以微西門子每米 (mS/m) 表示，通過電導率來判斷細胞完整性以及冷凍保藏劑對細胞的保護效果。

1.2.6 MpAFP698對小鼠血細胞低溫保存的影響

為了檢驗抗凍蛋白在血細胞保存方面的效果，采用后眼眶采血法采集昆明白小鼠血液，經2 000 r/min離心10 min棄上清。用10 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗滌紅細胞3?4 次，PBS重懸細胞，并將紅細胞稀釋為10%濃度。將75 μL 10%紅細胞懸液與不同體積的MpAFP698和BSA混合至終體積為150 μL，使抗凍蛋白終濃度為0.05 mg/mL，BSA終濃度為0.05 mg/mL。加入同體積PBS的細胞懸液作為陰性對照。每個樣品設3個重復。分別置于4 ℃、室溫 (20 ℃)、?20 ℃處理，觀察溶血情況并拍照。

1.2.7 MpAFP698對小鼠器官冷凍保存的影響

使用頸椎脫臼法處死昆明白小鼠，分別取出心、肝、脾、腎和股骨肌，用生理鹽水洗凈。實驗組使用抗凍蛋白溶液浸泡器官，對照組以生理鹽水浸泡器官，分別將實驗組和對照組置于4 ℃和?20 ℃處理后，制作小鼠組織器官的石蠟切片，用尼康光學顯微鏡觀察石蠟切片 (10×20倍)。

2 結果與分析

2.1 pPIC9K-Mpafp698轉化酵母菌的篩選

對整合了pPIC9K-外源基因的酵母菌提取基因組DNA，以3′AOX1和5′AOX1分別為上下游引物，進行PCR擴增 (圖2)。空白酵母由于自身帶有野生型AOX1基因，可擴增出一條2 200 bp的條帶。線性化的pPIC9K空載整合到酵母基因組后，PCR擴增會出現一條2 200 bp的條帶和一條來源于GS115/pPIC9K的AOX1基因，大小為492 bp (圖2，泳道1、2)。若宿主菌的基因組中整合了線性化的pPIC9K-，則PCR會擴增出一條 2 200 bp的條帶和一條與AOX1 (GS115/pPIC9K) 相融合、帶有目的基因的798 bp的條帶 (492 bp+ 306 bp) (圖2，泳道3?9)。

圖2 pPIC9K-Mpafp698整合的重組酵母的PCR 鑒定

2.2 發(fā)酵上清液中MpAFP698的電泳檢測

選取抗高濃度G418 (4.0 mg/mL) 的酵母菌株 (含pPIC9K-698) 和空載體轉化菌 (含pPIC9K) 進行甲醇誘導表達，上清液經TCA沉淀純化，制備成電泳樣品后，進行Tricine SDS-PAGE分析 (圖3)。泳道1?4是不同的重組轉化菌株，泳道5是空載體pPIC9K轉化菌。結果顯示，與空載體轉化菌相比，在15 kDa和30 kDa附近重組菌均有誘導表達蛋白的條帶出現，其中30 kDa條帶大于理論值，可能是二聚體。

圖3 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE檢測

2.3 Western blotting分析

將Tricine SDS-PAGE后的凝膠轉印到硝酸纖維素膜進行Western blotting 分析，結果顯示，pPIC9K-整合菌在15 kDa和30 kDa附近分別出現特異性條帶，而空載體轉化菌未出現任何條帶 (圖4)，證明重組菌表達的蛋白能被抗凍蛋白MpAFP698的特異性抗血清所識別，發(fā)生抗原抗體特異性免疫反應，表明MpAFP698獲得表達。其中30 kDa附近的條帶呈擴散狀，可能與存在不同程度的糖基化修飾或形成聚合體有關。每升發(fā)酵液中抗凍蛋白的表達量可達0.85 g，熱滯活性為1.55 ℃。

圖4 發(fā)酵上清液的Western blotting檢測

2.4 MpAFP698對SF9細胞低溫保存的影響

2.4.1 細胞計數

將對照組和分別添加了DMSO、BSA和MpAFP的不同處理組的細胞冰凍復蘇后，進行細胞計數。結果表明，添加抗凍蛋白組的細胞數顯著多于其他各組 (圖5)，說明抗凍蛋白可以有效地保護細胞。設置BSA無關蛋白組可以排除添加的蛋白本身對細胞存活的影響。

2.4.2 細胞顯微形態(tài)觀察

在上述細胞計數的同時，觀察細胞形態(tài)?？梢钥吹?，在冰凍復蘇后，添加MpAFP的SF9細胞形態(tài)飽滿，活細胞數高于對照組和添加DMSO保護劑的細胞 (圖6)，說明抗凍蛋白對細胞具有良好的抗凍保護作用。

2.4.3 電導率測定

通過檢測冰凍復蘇后細胞的電導率，可以判斷細胞完整性。結果表明，添加抗凍蛋白組的電導率和添加DMSO組的電導率均低于CK對照組 (圖7)，抗凍蛋白組極顯著地低于CK對照組 (2,6=25.10,0.01 (2,6)=10.92,＜0.01)，且顯著低于DMSO組 (2,6=8.815,0.05 (2,6)=5.143,＜0.05)，說明AFP組的細胞完整性較好。

圖5 不同處理組SF9細胞冰凍復蘇后的計數結果

圖6 不同處理組SF9細胞冰凍復蘇后的顯微形態(tài)觀察(10×20倍)

圖7 不同處理組SF9細胞冰凍復蘇后的電導率

2.5 MpAFP698對血細胞的保護效果

對紅細胞的保護實驗結果顯示，在室溫 (20 ℃) 放置2 d時，PBS空白對照組和BSA對照組都出現了渾濁，表明有溶血現象，而抗凍蛋白組的上清液仍保持清澈，溶血現象不明顯；在室溫放置4 d時3組均出現了渾濁，表明發(fā)生了溶血現象(圖8A)。在4 ℃放置2 d時，PBS組、BSA組和MpAFP處理組的血液上清液都很清澈，紅細胞溶血現象均不明顯；而在4℃放置4 d時，PBS組和BSA組都出現了嚴重的溶血現象，相比之下，添加抗凍蛋白組的上清液較為清澈，溶血現象較輕 (圖8B)，說明在4 ℃低溫條件下抗凍蛋白對紅細胞起到明顯的保護 效果。

圖8 不同溫度下MpAFP對紅細胞的保護效果

2.6 MpAFP698對組織器官的冷凍保護效果

檢測MpAFP698對低溫處理的小鼠肌肉、心、肝、腎的保護作用，石蠟切片在光學顯微鏡下 (10′20倍) 觀察顯示，與對照組相比，AFP組的肌肉 (圖9)、腎臟 (圖10)、肝臟 (圖12) 在4 ℃和?20 ℃處理后，細胞間隙較小，保護效果顯著。其中，抗凍蛋白對肝臟的保護效果在4 ℃最為顯著，而對心臟 (圖11) 的保護效果在兩種溫度下都不明顯。

圖9 MpAFP對肌肉保護的石蠟切片觀察(10× 20倍)

圖10 MpAFP對腎臟保護的石蠟切片觀察 (10× 20倍)

圖11 MpAFP對心臟保護的石蠟切片觀察(10× 20倍)

圖12 MpAFP對肝臟保護的石蠟切片觀察(10×20倍)

3 討論

利用抗凍蛋白進行生物材料的低溫保存，具有無毒無害、環(huán)保友好的優(yōu)勢。本研究通過構建荒漠昆蟲抗凍蛋白基因的酵母表達載體pPIC9K-，并將其整合到酵母基因組中，獲得了可分泌表達昆蟲抗凍蛋白的重組酵母菌GS115-pPIC9K-。經甲醇誘導表達，可獲得目的蛋白MpAFP698的分泌表達。以空載體轉化菌為對照，對發(fā)酵上清液進行Tricine SDS-PAGE檢測，結果顯示，分泌表達的絕大多數蛋白都是抗凍蛋白，表明該系統(tǒng)用于抗凍蛋白表達具有雜蛋白少、純化方便的優(yōu)勢，這與酵母pPIC9K表達載體分泌表達外源蛋白而自身蛋白很少分泌表達是一致的[22-23]。在15 kDa和30 kDa附近都出現了誘導表達的蛋白條帶，經免疫印跡分析，兩個條帶都能與目的蛋白MpAFP698產生特異性的抗原抗體反應，所以可以確定二者都是目的條帶。出現較大條帶的原因可能是糖基化、脂質化等修飾作用[24]。還可能存在多聚體現象，甲蟲抗凍蛋白的顯著特征是以不同數目的12-氨基酸重復序列組成的大量長短不一的蛋白質大家族，富含半胱氨酸[6]，有可能在分子間形成二硫鍵而聚合，導致蛋白多聚體的出現，30 kDa條帶有可能是二聚體。該蛋白的相關理化性質值得深入研究。我們所表達抗凍蛋白濃度為12.85 μmol/L (0.85 g/L)，熱滯活性為1.55 ℃，活性遠高于魚類抗凍蛋白，如美洲擬鰈Ⅰ型AFPs在濃度達400 μmol/L時，僅能使冰點降低0.27 ℃[25]，但這一活性低于黃粉蟲幼蟲天然抗凍蛋白的5.5 ℃[7]，可能是由于抗凍蛋白特殊的β-螺旋結構折疊不完全所致[26]。

荒漠甲蟲小胸鱉甲抗凍蛋白在冰凍條件下能夠有效保護SF9細胞，細胞復蘇后的活細胞數和生長狀態(tài)都比BSA對照組要好，電導率低于對照組，表明細胞膜的完整性較好。Tomczak等研究認為，抗凍蛋白具有穩(wěn)定膜結構的功 能[27]。Prathalingam等發(fā)現魚類Ⅰ型抗凍蛋白可以顯著提高精子細胞的滲透調節(jié)能力[28]。在室溫和低溫下的一定時間內，MpAFP都能有效保護紅細胞，與其能夠穩(wěn)定細胞膜結構的推測是一致的。這是首次報道抗凍蛋白在室溫條件下仍能發(fā)揮保護作用。除了對單細胞具有保護作用外[29]，本研究還發(fā)現，小胸鱉甲抗凍蛋白對組織器官在低溫下也有顯著的保護作用，尤其是對肝臟的低溫保護效果十分顯著，魚類抗凍糖蛋白對小鼠肝臟也有很好的低溫保護效 果[30]。比較抗凍蛋白對不同器官的低溫保護效果，發(fā)現MpAFP對心臟的保護效果不顯著，抗凍蛋白這種低溫保護效果的組織差異性的原因還有待深入研究。

本研究通過酵母表達系統(tǒng)獲得荒漠甲蟲抗凍蛋白MpAFP698，該蛋白可顯著改善冷凍小鼠肝臟等的細胞形態(tài)，提高SF9細胞的存活率，降低血細胞的溶血率，為今后利用基因工程手段降低生產成本、生產高活性的抗凍蛋白奠定了基礎，抗凍蛋白在醫(yī)學、農業(yè)、食品等領域將具有廣闊的應用前景。

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(本文責編 陳宏宇)

Yeast expression and application of an antifreeze protein from the desert beetle

Shanshan Meng, Wenping Cai, and Ji Ma

,,,830046,,

Insect antifreeze protein (AFP) has high antifreeze activity. Antifreeze proteins can be used in cryopreservation of biological tissues and cells. We expressed an antifreeze proteinfrom the desert beetlein yeast and determined the function of the protein at low temperatures. Yeast expression vector, pPIC9K-, was constructed and transformed intoGS115. The expression of MpAFP698 was induced by methanol, and identified by tricine SDS-PAGE and Western blotting.gene was inserted into the genome of the host yeast strain GS115, and correctly expressed. Hardly any yeast’s own protein was secreted into the media. Cryoprotective experiments showed that MpAFP698 can significantly protect mouse liver as well as other mouse organs from cold damage compared with those in the control of Bovine serum albumin (BSA) addition. Besides, the hemolysis of blood cells protected by MpAFP698 at 4 °C was reduced and the survival rate of SF9 cells protected by MpAFP698 after freezing and thawing was increased compared to those of the control with BSA addition. Our results showed that MpAFP698 can be expressed in yeast, which allows a convenient purification of the MpAFP protein that has the cryoprotective effect.

antifreeze proteins, cryopreservation, application,, blood cell

10.13345/j.cjb.140491

October 20, 2014; Accepted: December 10, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 31360527), Open Fund from Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (No. XJDX0201-2014-03).

Ji Ma. Tel/Fax: +86-991-8583517; E-mail: majiuci@xju.edu.cn

國家自然科學基金(No. 31360527)，新疆生物資源基因工程重點實驗室開放課題 (No. XJDX0201-2014-03) 資助。

2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1118.004.html