徐樂，巫琴，晉虎，陳磊，張衛(wèi)文

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集胞藻PCC 6803中脂肪酸激活酶Slr1609互作蛋白的鑒定

徐樂*，巫琴*，晉虎，陳磊，張衛(wèi)文

天津大學(xué)化工學(xué)院合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

徐樂, 巫琴, 晉虎, 等. 集胞藻PCC 6803中脂肪酸激活酶Slr1609互作蛋白的鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1194–1202.Xu L, Wu Q, Jin H, et al. Identification and characterization of partner proteins interacting with fatty acid activation enzyme Slr1609 in Synechocystis sp. PCC 6803. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1194–1202.

集胞藻中是編碼脂肪酸激活酶的基因，對與其相關(guān)的重要功能伴侶蛋白進(jìn)行研究，可以完善對脂肪酸合成模塊的認(rèn)識，為進(jìn)一步通過合成生物學(xué)技術(shù)改造藍(lán)細(xì)菌提供理論支持。本研究在集胞藻PCC 6803中建立了蛋白質(zhì)復(fù)合體分析及鑒定技術(shù)：利用氯霉素抗性基因篩選，構(gòu)建帶有3×FLAG 標(biāo)簽的Slr1609突變株，通過RT?PCR優(yōu)化重組蛋白表達(dá)條件；同時(shí)對突變株進(jìn)行了Western blotting鑒定，以及利用Native-PAGE驗(yàn)證了蛋白質(zhì)復(fù)合體的存在。最后，LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定獲得了Slr1609蛋白復(fù)合體中的可能伴侶蛋白。

，脂肪酸，蛋白質(zhì)復(fù)合體，藍(lán)細(xì)菌

藍(lán)細(xì)菌Cyanobacteria為最古老的光合自養(yǎng)型原核生物[1]，分布廣泛，適應(yīng)能力非常強(qiáng)，可以在冰凍、缺氧、高溫、干涸、高鹽及強(qiáng)輻射等極端環(huán)境中生長[2-3]。近年來，通過合成生物學(xué)改造藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料，正受到來自學(xué)術(shù)界和企業(yè)界越來越多的關(guān)注；利用藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)氫氣、乙醇、乙烯[4]、異戊二烯、正丁醇[5]、脂肪酸和脂肪醇等多種生物燃料分子已取得了一定的成功[6]。Atsumi 等[7]通過定向工程改造聚球藻PCC 7942從CO2直接生產(chǎn)異丁醛和異丁醇，并過表達(dá)二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco) 大幅度提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量。Lindberg等[8]用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P在集胞藻PCC 6803中異源表達(dá)葛根 (kudzu) 的基因，使之可以產(chǎn)生異戊二烯。Dexter等[9]通過同源雙交換的方法，將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的和基因整合到集胞藻PCC 6803染色體上，突變株可穩(wěn)定生產(chǎn)生物乙醇，且730為1的菌量日產(chǎn)乙醇5.2 mmol/L。集胞藻sp. PCC 6803是一種單細(xì)胞嗜中溫藍(lán)細(xì)菌，于1996年完成基因組測序[10]。其具有遺傳背景清楚、生長快速、光合作用效率高[11]、培養(yǎng)條件簡單、不產(chǎn)毒素、具有天然外源DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[12]等特點(diǎn)，是研究光合作用以及合成生物學(xué)改造研究的重要模式菌株和底盤細(xì)胞[13]。

藍(lán)細(xì)菌的脂肪酸族生物燃料合成離不開其脂肪酸的代謝途徑。脂肪酸合成途徑屬于Ⅱ型脂肪酸合成途徑[14]。集胞藻PCC 6803在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)存在大量自由脂肪酸，而這些自由脂肪酸需要被脂肪酸激活酶激活成為脂酰CoA或脂酰ACP，才能被下游的膜脂合成途徑、脂肪醇和脂肪烴等代謝途徑所利用[15-16]。在近期的工作中，Liu等[17]使用基因工程和代謝工程技術(shù)改造集胞藻PCC 6803使其生產(chǎn)C10?C18脂肪酸，最高產(chǎn)量達(dá) (197±14) mg/L。同時(shí)使用CO2誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，構(gòu)建CO2誘導(dǎo)融膜系統(tǒng)，突變株SD239回收的脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到36.1×10–12mg/cell[18]。這一研究工作表明工程藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)脂肪族類液體生物燃料的產(chǎn)量提高還有很大的空間。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝活動(dòng)的主要承擔(dān)者，它們通常通過形成蛋白質(zhì)復(fù)合體來行使功能，所以脂肪酸合成相關(guān)酶復(fù)合體的研究對于了解細(xì)胞代謝調(diào)控機(jī)理等具有重要的意義。復(fù)合體的純化分離現(xiàn)階段主要有免疫共沉淀、標(biāo)簽標(biāo)記親和純化、GST沉降技術(shù)和串聯(lián)親和純化等[19]。Boehm等[20]用BN-PAFE驗(yàn)證了FPLC對集胞藻PCC 6803中光合系統(tǒng)Ⅱ的分離效果。Ma等[21]先用Native-PAGE分離出NDH-1復(fù)合體，再通過第二維的SDS-PAGE分離出8個(gè)條帶。Brown 等[22]利用串聯(lián)親和純化技術(shù)(TAP) 在集胞藻PCC 6803純化出少量的脂肪酸合成酶(FAS) 復(fù)合體。以上研究成果證明通過蛋白質(zhì)復(fù)合體純化分離及鑒定技術(shù)可以為藍(lán)細(xì)菌研究提供重要的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。

在早期研究中，Von Berlepsch等[15]將基因敲除，利用同位素示蹤法對集胞藻PCC 6803的脂肪酸代謝途徑進(jìn)行詳細(xì)分析，最后推測是編碼藍(lán)細(xì)菌中唯一的脂肪酸激活酶的基因。近期Gao等[23]通過對這一基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)既存在于細(xì)胞膜系統(tǒng)中，也存在于細(xì)胞質(zhì)中。本研究針對編碼脂肪酸激活酶的基因[23]展開互作蛋白的鑒定和分析研究，以期完善對脂肪酸合成模塊的認(rèn)識，為進(jìn)一步通過合成生物學(xué)技術(shù)改造藍(lán)細(xì)菌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

集胞藻sp. PCC 6803從American Type Culture Collection購買，培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基，30 ℃，50 μmol/(m2?s) 和130 r/min條件搖瓶培養(yǎng)[24]。

含氯霉素抗性質(zhì)粒pACYC184的大腸桿菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖瓶中培養(yǎng)12?24 h。

1.2 突變株的構(gòu)建

在的C端插入3×FLAG標(biāo)簽，并在其后插入氯霉素抗性基因。從Cyanobase數(shù)據(jù)庫獲取基因序列(http://genome.microbedb. jp/cyanobase/Synechocystis)，并用Primer 5設(shè)計(jì)引物，其中R1含有3×FLAG標(biāo)簽(表1)。首先用表1中的引物分別PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因C端插入3×FLAG標(biāo)簽的上游片段，氯霉素抗性基因的中游片段和基因的下游片段，3條片段的長度都約為1 kb。再以F1和R3為引物，融合PCR擴(kuò)增出大小約為3 kb的線性DNA片段(圖1)。PCR反應(yīng)條件如下：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，72 ℃退火10 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。將3 kb線性DNA片段轉(zhuǎn)化到集胞藻PCC 6803中，篩選抗性菌落，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

表1 融合PCR所用引物

圖1 用融合PCR方法插入3×FLAG標(biāo)簽原理

1.3 RT-qPCR (Reverse transcription quantitative PCR) 分析

用RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上檢測不同培養(yǎng)時(shí)間下的基因表達(dá)，用作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。引物見表2。取3 d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行樣，用ZR RNA MicroPrep? RNA Kit (ZYMO) 提取總RNA，再用SuperScript?VILO? cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) 將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后用Power SYBR?Green RT?PCR Reagents Kit (ABI)配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.4 蛋白質(zhì)的提取及純化

1.4.1 蛋白質(zhì)的提取

采用珠磨法破碎細(xì)胞，取1 L培養(yǎng)5 d的集胞藻PCC 6803菌液，4 ℃、7 500 r/min離心 15 min，棄上清，并均勻分別轉(zhuǎn)入10個(gè)1.5 mL離心管中。加入與菌體等體積的玻璃珠(直徑0.1 mm)，再加入100 μL裂解液(20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH 7.4，10 mmol/L MgCl2，5 mmol/L CaCl2，20%甘油，1% β-DM)，PMSF終濃度為1 mmol/L[25]重懸。放入樣本快速破碎勻漿儀(天津歐諾) 中進(jìn)行破碎(30 s，2 min冰浴，4 500 r/min，6個(gè)循環(huán))，離心取上清混在一起記為蛋白粗提液。

表2 RT-PCR引物

1.4.2 蛋白質(zhì)的純化

Gel預(yù)處理：1) 將ANTI-FLAG M2 Affinity Gel置于冰上融化后，取10 μL于離心管中，4 ℃、8 000×離心30 s，去上清；2) 向離心管中加入1 mL裂解液，輕輕顛倒搖動(dòng)清洗Gel，4 ℃、 8 000×離心30 s，去上清；3) 重復(fù)清洗1次。

蛋白質(zhì)結(jié)合：1) 向Gel中加入1 mL蛋白質(zhì)粗提物；2) 4 ℃輕柔振蕩過夜，然后4 ℃、8 000×離心30 s，去上清。

Gel清洗：1) 向Gel中加入1 mL 裂解液，輕輕顛倒搖動(dòng)清洗Gel，4 ℃、8 000×離心30 s，去上清；2) 重復(fù)清洗2次。

蛋白質(zhì)洗脫：1) 配制洗脫液：100 μL 蛋白純化洗脫緩沖液 (20 mmol/L HEPES，pH 7.4，10 mmol/L MgCl2，5 mmol/L CaCl2，150 mmol/L NaCl，20%甘油) 中加入6 μL 5 μg/μL 3×FLAG peptide溶液，終濃度為300 ng/μL。2) 將洗脫液加入Gel中，在冰上輕柔振蕩1 h，在4 ℃下，8 000×離心30 s，上清即為純化的蛋白。

以上過程均在冰上進(jìn)行以防抗體失效。

1.5 Western blotting檢測純化產(chǎn)物

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法[26]進(jìn)行Western blotting。蛋白樣品的上樣量為20 μL (約300 ng)，用SDS-PAGE (12%) 或Native-PAGE (5%) 進(jìn)行分離，通過電轉(zhuǎn)移方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)。

用鼠抗FLAG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG分別作為一抗和二抗進(jìn)行免疫印跡檢測，ECL檢測試劑盒顯色后用Chemi Doc XRS+凝膠成像儀曝光成像。

1.6 蛋白質(zhì)復(fù)合體成分的質(zhì)譜鑒定

取20 μL純化后蛋白質(zhì)溶液，進(jìn)行Native-PAGE并進(jìn)行銀染(Sigma)。切下所對應(yīng)條帶即為全細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合體樣品。將蛋白樣品酶解處理，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)。對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用數(shù)據(jù)分析軟件即Data Analysis Software軟件標(biāo)峰后，將原始文件轉(zhuǎn)換成mgf格式，再用Mascot search engine version 2.3.01將數(shù)據(jù)與已建立的集胞藻PCC 6803全蛋白數(shù)據(jù)庫(來自于NCBI) 進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索比對。其中，Mascot程序使用基于概率的MOWSE算法、前體肽離子/信息和MS-MS肽片段離子數(shù)據(jù)來鑒定蛋白質(zhì)。

搜索的參數(shù)設(shè)置如下：Database: PCC 6803；Taxonomy: All entries；Enzyme: Trypsin；Missed missed cleavage: 1；Fixed modification: Carbamidomethyl(C)；Quantitation method: None；Varied modification: Oxidation(M), Gln->pyro-Glu(N-term Q)；Peptide mass tolerance: ±0.1 Da；Fragment Mass Tolerance: ±0.1 Da；Mass values: Monoisotopic；Instrument type: ESI-QUAD-TOF；

進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索時(shí)，蛋白鑒定的Mascot score值大于14 (<0.05)，序列覆蓋度(Sequence coverage) >1%則認(rèn)為是陽性匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 slr1609突變株的構(gòu)建

集胞藻PCC 6803經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，從平板上挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，由于集胞藻PCC 6803含有多條染色體，所以需要檢驗(yàn)是否單菌落的細(xì)胞中所有染色體均帶上3×FLAG標(biāo)簽以及氯霉素抗性基因。菌落PCR利用擴(kuò)增上、下游同源臂的特異性引物F1和R3進(jìn)行，分別以突變株和野生株為擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR，然后通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測擴(kuò)增片段大小是否正確。由于突變株中插入了3×FLAG標(biāo)簽以及氯霉素抗性基因，與集胞藻PCC 6803野生株相比大了1 kb左右，若替換完全，突變株菌落PCR應(yīng)當(dāng)只得到一條3 kb的條帶，而野生株只有2 kb左右的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2，可知突變型菌株已經(jīng)完全替換。

2.2 突變株培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

圖2 菌落PCR

表3 slr1609和rnpB的RT-PCR CT值

RNA preparation, reverse transcription and real-time PCR were performed as described in section 1.3.

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)slr1609的相對表達(dá)量

2.3 帶3×FLAG標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎谋磉_(dá)、純化及Western blotting分析

根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)，編碼的脂肪酸激活酶的蛋白質(zhì)分子量為77.7 kDa，而3×FLAG標(biāo)簽的大小為2.7 kDa，可以計(jì)算出融合蛋白大小約為80.4 kDa。取 200 mL培養(yǎng)5 d的突變株和野生株，用BugBuster Master Mix (Novagen) 提取蛋白質(zhì)，并通過Western blotting (12%分離膠) 初步驗(yàn)證3×FLAG標(biāo)簽的表達(dá)。從圖4可以看出，突變株中的C端插入3×FLAG標(biāo)簽后仍能夠正常表達(dá)，并且蛋白分子量大小也正確，而在集胞藻PCC 6803野生株檢測不到3×FLAG信號，在蛋白水平表明突變株的正確構(gòu)建和3×FLAG標(biāo)簽具有較強(qiáng)的特異性，可以用于蛋白質(zhì)復(fù)合體的分析。

2.4 檢測蛋白質(zhì)復(fù)合體純化效果

取1 L培養(yǎng)5 d的突變株培養(yǎng)液，按照上述方法純化突變株中的蛋白質(zhì)。取20 μL突變株純化后蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行Native-PAGE并進(jìn)行銀染(圖5A)，同時(shí)蛋白溶液稀釋10倍后等量進(jìn)行Western blotting分析，以檢測融合蛋白是否以蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式被純化出來，分離出的復(fù)合體以備質(zhì)譜分析。圖5B中的Western blotting結(jié)果可以看出分子量大于170 kDa的位置顯示明顯的FLAG信號；圖5A中可以看出，突變株純化后的蛋白質(zhì)在分子量大于170 kDa的位置同樣有蛋白質(zhì)存在，表明細(xì)胞中Slr1609融合蛋白以蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式被純化和分離出來，并且可能因?yàn)橐恍┑鞍椎碾x體產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。

圖4 Western blotting驗(yàn)證3×FLAG標(biāo)簽的插入與表達(dá)

圖5 Native-PAGE檢測蛋白質(zhì)復(fù)合體純化效果

2.5 質(zhì)譜結(jié)果分析

將上述銀染后的蛋白帶切下后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，再把NanoLC-MS/MS結(jié)果提交至集胞藻PCC 6803全蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，在肽段容差 ±0.1 Da、<0.05的檢索條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索比對，根據(jù)蛋白質(zhì)豐度、序列匹配程度與覆蓋率、檢測到肽段數(shù)量及可信度、同一肽段檢測次數(shù)等指標(biāo)，對鑒定出的結(jié)果進(jìn)行綜合評分，共鑒定到5個(gè)陽性結(jié)果 (表4)。其中，Slr1834鑒定得分為30，有3個(gè)肽段歸屬于同一蛋白質(zhì)，2個(gè)肽段可信度超過閾值分?jǐn)?shù) (<0.05)，覆蓋率為4%；Slr1783鑒定得分為21，鑒定到1個(gè)可信度超過閾值分?jǐn)?shù) (<0.05) 的肽段，覆蓋率為6%；Slr0415鑒定得分為19，有3個(gè)肽段歸屬于同一蛋白質(zhì)，1個(gè)肽段可信度超過閾值分?jǐn)?shù) (<0.05)，覆蓋率為3%；Sll0350鑒定得分為19，有3個(gè)肽段歸屬于同一蛋白質(zhì)，1個(gè)肽段可信度超過閾值分?jǐn)?shù) (<0.05)，覆蓋率為1%；Slr1609鑒定得分為18，鑒定到1個(gè)可信度超過閾值分?jǐn)?shù) (<0.05) 的肽段，覆蓋率為2%。

從表中可以看出LC-MS/MS鑒定得到的各個(gè)蛋白質(zhì)的功能。Slr1834是光系統(tǒng)Ⅰ中P700-葉綠素a復(fù)合體上的脫輔基蛋白亞基，屬于能量代謝中光合作用的功能蛋白；Slr1783是雙組分信號系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)控子NarL的亞基，屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控功能蛋白；Slr0415是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于運(yùn)載功能蛋白；Sll0350是未知功能蛋白；Slr1609是我們的目標(biāo)融合蛋白，即脂肪酸激活酶。此結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了我們的純化和Native-PAGE系統(tǒng)正確地將Slr1609及其蛋白質(zhì)復(fù)合體的蛋白進(jìn)行了成功分離。

通過對上述蛋白質(zhì)的功能分析，Slr1834、Slr1783和Slr0415 3個(gè)蛋白均為細(xì)胞膜中常見的參與光合作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)載的功能蛋白，可能是由于這些蛋白的豐度較高從而非特異性結(jié)合在純化柱上，造成親和純化不可避免的假陽性。質(zhì)譜還鑒定出一個(gè)未知功能蛋白Sll0350，利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) 工具對該蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，并未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域，可以排除膜蛋白的可能性，而鑒于此蛋白可能與脂肪酸激活酶Slr1609形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，因此我們認(rèn)為該蛋白有可能與脂肪酸代謝有關(guān)，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(例如，基因敲除等) 驗(yàn)證來提供更有力的證據(jù)。

表4 LC-ESI-MS/MS檢測蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)果

3 結(jié)論

目前對多不飽和脂肪酸的代謝和調(diào)控途徑的認(rèn)識十分有限，限制了將這類高效代謝和調(diào)控模塊用于大幅度提高生物產(chǎn)品。集胞藻PCC 6803中脂肪酸合成相關(guān)的酶復(fù)合物研究，對大規(guī)模生成多不飽和脂肪酸這種重要生物產(chǎn)品有重要意義。迄今為止，我們建立并優(yōu)化了集胞藻PCC 6803中高通量快速的基因突變體系：經(jīng)過優(yōu)化過的融合PCR方法，從拿到引物到獲得基因突變所需DNA片段并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，僅需半天時(shí)間。利用RT-PCR技術(shù)通過鑒定目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平，優(yōu)化了重組蛋白表達(dá)條件。對3×FLAG標(biāo)記的突變株進(jìn)行了Western blotting鑒定。利用LC-MS/MS鑒定了重組突變株目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合體成分，質(zhì)譜結(jié)果表明，蛋白質(zhì)復(fù)合體中能夠檢測到目標(biāo)蛋白Slr1609，證明3×FLAG標(biāo)簽構(gòu)建正確且能正常表達(dá)純化，整個(gè)重組突變-親和純化技術(shù)是可行的。質(zhì)譜結(jié)果還鑒定出一個(gè)未知功能蛋白Sll0350，可能是與脂肪酸代謝有關(guān)的蛋白。下一步實(shí)驗(yàn)中我們將利用分子生物學(xué)(基因敲除、基因過表達(dá)等) 和組學(xué)手段(基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等) 對有效候選伴侶蛋白進(jìn)行功能研究與鑒定，進(jìn)而解析集胞藻PCC 6803中多不飽和脂肪酸相關(guān)代謝和調(diào)控途徑。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Identification and characterization of partner proteins interacting with fatty acid activation enzyme Slr1609 insp. PCC 6803

Le Xu*, Qin Wu*, Hu Jin, Lei Chen, and Weiwen Zhang

Laboratory of Synthetic Microbiology, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

To understand molecular modules related to polyunsaturated fatty acids (PUFA) synthesis and eventually produce PUFA at high efficiency, we developed a protein complex analysis technology insp. PCC 6803, and applied it to identify possible partner proteins interacting with the key enzymes that catalyze PUFA biosynthesis. We first constructed a recombinant expression of protein ofencoding the fatty acid activation enzyme, by fusing 3×FLAG tag with the target protein. Then we verified its expression by Western blotting targeting 3×FLAG tag. To maximize purification of Slr1609 protein complex, we optimized the protein expression conditions of Slr1609 inin a 5 L fermenter by monitoring itsgene expression using RT-qPCR. The purification of the Slr1609 protein complexes was demonstrated by a Native-PAGE analysis. Finally, LC-MS/MS proteomic analysis allowed identification of the possible partner proteins interacting with Slr1609.

, fatty acid, protein complex, cyanobacterium

10.13345/j.cjb.140492

October 20, 2014;Accepted:January 22, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2012CB721101, 2011CBA00803).

Lei Chen. Tel: +82-22-27406364; Fax: +86-22-27403389; E-mail: lchen@tju.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (Nos. 2012CB721101, 2011CBA00803) 資助。

2015-03-25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150325.1122.003.html