劉蓉，楊國(guó)偉，吳月燕，饒慧云，李學(xué)孚,2，李美芹,2，錢萍仙

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光照強(qiáng)度對(duì)葡萄愈傷組織形成過(guò)程中相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響

劉蓉1，楊國(guó)偉1，吳月燕1，饒慧云1，李學(xué)孚1,2，李美芹1,2，錢萍仙1

1 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100 2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

劉蓉, 楊國(guó)偉, 吳月燕, 等. 光照強(qiáng)度對(duì)葡萄愈傷組織形成過(guò)程中相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1219–1229.Liu R, Yang GW, Wu YY, et al. Effects of light intensity on associated enzyme activity and gene expression during callus formation of Vitis vinifera. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1219–1229.

文中分析了葡萄愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的最佳光照強(qiáng)度并探索葡萄愈傷組織褐變的機(jī)理。以金手指葡萄的幼嫩莖段為材料，設(shè)置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000和4 000 Lx等8個(gè)光照強(qiáng)度，研究不同光照強(qiáng)度對(duì)葡萄愈傷組織的誘導(dǎo)率、褐化率及相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在0、500、1 000和1 500 Lx光照強(qiáng)度處理下，愈傷組織的誘導(dǎo)率均達(dá)到92%以上，顯著高于其他處理 (<0.05)，其中 1 000和1 500 Lx光照強(qiáng)度處理愈傷組織及其繼代培養(yǎng)的生長(zhǎng)勢(shì)良好且褐化程度較輕；綠原酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸與葡萄愈傷組織褐變關(guān)系密切，其中綠原酸的含量與褐化程度呈顯著正相關(guān)(<0.05）；POD和PPO酶活性與褐化率呈極顯著負(fù)相關(guān) (<0.01)；、和酶基因的表達(dá)量與褐化率呈顯著(<0.05) 或極顯著(<0.01) 正相關(guān)。因此，葡萄愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)適宜的光照強(qiáng)度為1 000?1 500 Lx，光照強(qiáng)度過(guò)高或過(guò)低對(duì)其正常的生理生長(zhǎng)都有較大負(fù)面影響。

葡萄，愈傷組織，光照強(qiáng)度，誘導(dǎo)率，褐化率，酶活性，基因表達(dá)

葡萄枝、葉富含酚類化合物，利用嫩枝和幼葉進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)容易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，有效控制愈傷組織的褐化是葡萄組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。葡萄組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促反應(yīng)引起，而酶促反應(yīng)必須具有底物、酶和氧等3個(gè)條件[1]。一般認(rèn)為酚酸類物質(zhì)是外植體酶促褐變過(guò)程中的底物，主要包括苯基羧酸 (鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等)、苯丙烷衍生物 (綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等)、黃烷衍生物 (花青素、黃酮、蕓香苷等)，其含量與外植體褐變密切相關(guān)[2]。引起酶促褐變的幾個(gè)關(guān)鍵酶有多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase，PPO)、過(guò)氧化物酶 (Peroxidase，POD) 和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)[3]。PPO是催化褐變反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能催化酚類物質(zhì)到聯(lián)苯酚的羥基化以及羥基酚到醌的脫氫反應(yīng)，醌在植物體內(nèi)自身聚合，或與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生黑色或褐色的沉積物，被認(rèn)為是植物體酶促褐變的主要原因[4]；POD是植物防御中的第一道防線，有報(bào)道表明POD和PPO共同氧化酚成醌，醌轉(zhuǎn)變成縮合型鞣質(zhì)，最后形成褐色的聚合體[2]。研究表明POD酶活性與愈傷組織的褐化率呈負(fù)相關(guān)，PPO和PAL酶活性與其褐化程度呈正相關(guān)[5-7]；亦有報(bào)道表明褐化程度與和酶基因的表達(dá)呈正相關(guān)[7-8]，與酶基因的表達(dá)有關(guān)[9-10]。引起葡萄愈傷組織褐化的因素復(fù)雜，如品種、外植體的類型和環(huán)境條件 (如氧氣、溫度和光照)等，其中外界環(huán)境條件的調(diào)控是降低愈傷組織褐化率的重要手段。作者在葡萄組織培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)墓庹諒?qiáng)度能有效地降低愈傷組織的褐化，但目前光照對(duì)植物愈傷組織褐化影響的機(jī)理鮮有報(bào)道。

本文通過(guò)分析不同光照強(qiáng)度下葡萄愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)以及相關(guān)酚酸類物質(zhì)酶的活性和基因表達(dá)量的變化，探索光照強(qiáng)度導(dǎo)致葡萄愈傷組織褐化的機(jī)理，為葡萄愈傷組織誘導(dǎo)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄品種為“金手指” (Gold finger)，采自寧波市鎮(zhèn)海區(qū)長(zhǎng)石村浙江萬(wàn)里學(xué)院葡萄試驗(yàn)基地 (29°96〞N, 121°72〞E)。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

根據(jù)前期研究，本試驗(yàn)愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織繼代培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，培養(yǎng)基中的蔗糖和瓊脂濃度分別為3%和0.6%，pH為5.8?5.9。

愈傷組織的誘導(dǎo)主要參考前人的研究方法[11]結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)設(shè)置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000和4 000 Lx等8個(gè)處理。愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)取葡萄的幼嫩莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶5段外植體，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次，28 d后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率、褐化率及生長(zhǎng)狀況等；同時(shí)選取生長(zhǎng)狀況基本一致的愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)試驗(yàn)，每瓶5塊愈傷，每塊愈傷大小約1.0 cm2，每個(gè)處理6瓶，重復(fù)3次，20 d后觀察其生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)褐化率；分析不同處理酚酸類成分、相關(guān)的酶活性及酶基因的表達(dá)。用SPSS18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

愈傷組織的誘導(dǎo)率=(長(zhǎng)出愈傷組織的外植體塊數(shù)/總接種的外植體塊數(shù))×100%；

愈傷組織的褐化率=(褐化的愈傷組織塊數(shù)/總接種的愈傷組織塊數(shù))×100%。

培養(yǎng)室25 ℃恒溫、16 h/8 h的光/暗條件。

1.2.2 酚類的定性定量測(cè)定

采用液相色譜，色譜系統(tǒng)為1100高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent 公司)。乙酸和甲醇均為色譜純；沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶酚、香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品 (≥99%，Sigma公司)。水用Mill-iQ (美國(guó)Millipore公司) 超純水儀處理 (18 M)；流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的制備參考呂海濤等[12]的方法。

色譜柱：EclipseXDB-C18 (150 mm×4.6 mm .i d.，5 μL)，流動(dòng)相：A為甲醇；B為1%乙酸水溶液()；梯度洗脫程序：溶劑A在40 min內(nèi)由5%上升到30%，然后變?yōu)?00%，并維持5 min，最后再返回到初始狀態(tài)。柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.3 酶活性的測(cè)定

POD酶活性參考魏建梅等[13]的方法，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小，酶活性單位為Δ470/(min·g)；PPO酶活性參考鄭小林等[14]的方法，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小，酶活性單位為Δ420/(min·g)；PAL酶活性參考王勇等[15]的方法測(cè)定，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小，酶活性單位為Δ290/(min·g)。

1.2.4、、酶基因的qRT-PCR測(cè)定

qRT-PCR主要參考前人的研究方法[16]適當(dāng)改進(jìn)?？俁NA提取所用試劑盒購(gòu)于Genotheramics公司；DNaseⅠ酶液購(gòu)于康為世紀(jì)公司。對(duì)所提取RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，共3條譜帶 (28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA) 且28S rRNA和18S rRNA亮度比約為2∶1，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260/280在1.8?2.0之間，表明所提取RNA完整性好、無(wú)降解且純度較好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。提取的RNA保存在–80 ℃冰箱中備用。按康為世紀(jì)公司的SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒的方法合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 (20 μL)為：dNTPs 4 μL，混合引物2 μL，RNA模板5 μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液 (5×) 4 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，無(wú)RNA酶水4 μL。根據(jù)葡萄、和基因的全長(zhǎng)序列，按照相對(duì)熒光定量RT-PCR引物設(shè)計(jì)原則在基因3′區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，以為內(nèi)參設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物 (表1)，分別用于不同光照條件下各基因表達(dá)分析。反應(yīng)在Invitrogen公司ABI 7500 FAST實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，方法參照全式金生物技術(shù)有限公司熒光定量試劑盒TransStart Green qPCR SuperMix UDG說(shuō)明書。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為：cDNA模板1 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，酶液 (含UDG) 10 μL，校準(zhǔn)液 (50×) 0.4 μL，加水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序采用兩步法：50 ℃ UDG孵育2 min，94 ℃ 10 min UDG失活，94 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性34 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，采用ABI 7500分析軟件中Comparative CT (ΔΔCT) 法分析試驗(yàn)結(jié)果。

表1 熒光定量PCR引物序列

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2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如圖1和表2所示，光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、褐化程度及生長(zhǎng)狀況均有一定程度的影響。光照強(qiáng)度為0、500、1 000和1 500 Lx處理的誘導(dǎo)率顯著高于2 000、2 500、3 000和4 000 Lx光照強(qiáng)度處理 (<0.05)，其中光照強(qiáng)度1 500 Lx處理誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為98.69%，光照強(qiáng)度4 000 Lx處理誘導(dǎo)率最低，僅為32.93%；光照強(qiáng)度對(duì)褐化率的影響則相反，光照強(qiáng)度0、500、1 000和1 500 Lx處理褐化率分別為2.56%、3.05%、5.23%和3.56%，顯著低于2 000、2 500、3 000和4 000 Lx光照處理 (<0.05)，其中光照強(qiáng)度4 000 Lx處理褐化率最高達(dá)到93.22%；試驗(yàn)亦表明光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀況有較大的影響，0 Lx和500 Lx光照處理愈傷組織呈乳白色和淡黃色，生長(zhǎng)勢(shì)一般，褐化程度較輕，1 000 Lx和1 500 Lx光照強(qiáng)度處理愈傷組織分別為黃綠色和淺綠色，且生長(zhǎng)勢(shì)良好，光照強(qiáng)度大于1 500 Lx時(shí)愈傷組織呈雪花狀或松散雪花狀且生長(zhǎng)勢(shì)較差。因此，葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的適宜光照強(qiáng)度為1 000?1 500 Lx。

2.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

如圖2和表3所示，不同光照強(qiáng)度對(duì)繼代培養(yǎng)的愈傷組織褐化率影響差異顯著(<0.05)，光照強(qiáng)度0、500、1 000和1 500 Lx處理褐化率顯著低于2 000、2 500、3 000和4 000 Lx光照強(qiáng)度處理 (<0.05)，其中光照強(qiáng)度為1 500 Lx時(shí)愈傷組織的褐化率最低，僅為8.15%，光照強(qiáng)度達(dá)到4 000 Lx處理褐化率最高達(dá)到98.44%。試驗(yàn)亦表明光照強(qiáng)度對(duì)繼代后的愈傷組織生長(zhǎng)亦有一定程度的影響，光照強(qiáng)度0 Lx和500 Lx處理愈傷組織呈乳白色和淡黃色，生長(zhǎng)勢(shì)一般；光照強(qiáng)度 1 000和1 500 Lx處理愈傷組織呈淡黃色和黃綠色，生長(zhǎng)勢(shì)較好，且褐化率較低；光照強(qiáng)度為2 000 Lx強(qiáng)度處理，愈傷組織呈黃綠色，褐化率顯著高于1 500 Lx處理 (<0.05)，且生長(zhǎng)勢(shì)一般；光照強(qiáng)度大于2 000 Lx時(shí)愈傷組織呈雪花狀或松散雪花狀，生長(zhǎng)勢(shì)較差，褐化程度顯著高于0、500、1 000、1 500和2 000 Lx處理。因此，葡萄愈傷組織繼代培養(yǎng)的適宜光照強(qiáng)度條件為1 000?1 500 Lx。

圖1 不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

圖2 不同光照強(qiáng)度下的愈傷組織生長(zhǎng)狀況

表3 不同光照強(qiáng)度下愈傷繼代的生長(zhǎng)情況

2.3 不同光照強(qiáng)度下愈傷組織中酚類物質(zhì)的變化

圖3是多酚標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖和樣品中多酚類物質(zhì)HPLC色譜圖。由標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可知，7種酚類物質(zhì)得到了很好的分離，且峰形對(duì)稱；從樣品色譜圖可以看出，未檢測(cè)到?jīng)]食子酸和兒茶酚，其余5種酚類物質(zhì)出峰時(shí)間與混標(biāo)原液的出峰時(shí)間基本一致，所檢測(cè)到的5種酚類物質(zhì)彼此完全分離，分離效果良好。

圖3 多酚標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜(A)和樣品HPLC色譜圖 (B)

表4 不同光照條件下愈傷組織中酚類物質(zhì)的含量

由表4可知，1 500 Lx強(qiáng)度處理香豆酸的含量最高達(dá)到0.70 mg/g，顯著高于其他處理(<0.05)，0、1 000、2 000、2 500、3 000 Lx次之，且各處理之間差異不顯著 (0.05)，4 000 Lx光照強(qiáng)度處理香豆酸的含量最低僅為0.35 mg/g；1 500 Lx光照強(qiáng)度處理對(duì)羥基苯甲酸的含量最高達(dá)到3.63 mg/g，顯著高于其他處理 (<0.05)，2 000 Lx光照強(qiáng)度處理次之，4 000 Lx光照強(qiáng)度處理最低，僅為0.97 mg/g；4 000 Lx光照強(qiáng)度處理綠原酸的含量達(dá)到19.58 mg/g，顯著高于其他處理 (<0.05)，3 000 Lx光照強(qiáng)度處理次之，1 500 Lx光照強(qiáng)度處理最低，僅為0.36 mg/g；0 Lx光照強(qiáng)度處理咖啡酸的含量顯著高于其他處理 (<0.05)，500 Lx和3 000 Lx光照強(qiáng)度處理次之，其他處理之間差異不顯著 (0.05)； 1 500 Lx光照強(qiáng)度處理阿魏酸的含量最高，顯著高于0、500、1 000、3 000和4 000 Lx (<0.05) 光照處理，但與2 000 Lx和2 500 Lx光照強(qiáng)度處理差異不顯著(0.05)，1 000 Lx光照強(qiáng)度處理阿魏酸的含量最低，僅為1.02 mg/g。

2.4 不同光照處理對(duì)POD、PPO和PAL酶活性的影響

如圖4所示，不同光照強(qiáng)度對(duì)POD、PPO和PAL酶活性的影響不同，1 500 Lx光照強(qiáng)度處理POD酶活性最高達(dá)到26.4 Δ470/(min·g)，與0、2 000、2 500、3 000和4 000 Lx光照強(qiáng)度處理差異極顯著 (<0.01)，其中光照強(qiáng)度4 000 Lx時(shí)POD酶活性降到最低僅為1.2 Δ470/(min·g)；4 000 Lx光照強(qiáng)度處理PPO酶的活性最高達(dá)到29.2 Δ420/(min·g)，極顯著高于其他處理(<0.01)，其次為2 500 Lx和3 000 Lx，其他處理PPO酶的活性均較低； 0 Lx和1 500 Lx光照強(qiáng)度處理下PAL酶的活性分別為28.2 Δ290/(min·g)和25.1 Δ290/(min·g)，極顯著低于其他處理 (<0.01)，其他處理之間差異不顯著。

圖4 不同光照強(qiáng)度下POD (A)、PPO (B) 和PAL (C)酶的活性

2.5 不同光照處理對(duì)POD、PPO和PAL酶基因表達(dá)量的影響

如圖5所示，不同光照強(qiáng)度對(duì)、和酶基因的表達(dá)量均有一定程度的影響。 4 000 Lx光照強(qiáng)度處理酶基因表達(dá)量最高，與其他光照強(qiáng)度處理差異極顯著 (<0.01)，其他處理之間差異不顯著 (>0.05)，且光照強(qiáng)度1 500 Lx處理酶基因表達(dá)量?jī)H為4 000 Lx光照強(qiáng)度處理的0.21倍；4 000 Lx光照強(qiáng)度處理酶基因表達(dá)量最高，且極顯著高于其他處理(<0.01)，3 000 Lx次之。0、500、1 000和1 500 Lx光照強(qiáng)度處理表達(dá)量較低，分別僅為4 000 Lx光照強(qiáng)度處理的0.18、0.18、0.16和0.19倍； 4 000 Lx光照強(qiáng)度處理酶基因表達(dá)量最高，極顯著高于其他處理 (<0.01)，1 000、2 000、2 500和3 000 Lx次之，0、500、1 500 Lx光照強(qiáng)度處理其表達(dá)量最低，其中1 500 Lx光照強(qiáng)度處理基因的表達(dá)量?jī)H為4 000 Lx處理的0.48倍。

2.6 愈傷組織褐變率與酶活性及其表達(dá)量的相關(guān)性分析

如表5所示，褐變率與酶活性及酶基因表達(dá)量之間存在一定的相關(guān)性。褐變率與POD酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與其表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是–0.894和0.765；褐變率與PPO酶活性及其表達(dá)量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.850和0.919，且PPO酶活性與其表達(dá)量亦呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.944；褐變率僅與基因表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.812。

圖5 不同光照強(qiáng)度下POD (A)、PPO (B) 和PAL (C)酶基因的表達(dá)量

表5 愈傷組織褐變率與酶活性及其表達(dá)量的相關(guān)性分析

X1: browning rate; X2: activity of POD; X3: expression of POD; X4: activity of PPO; X5: expression of PPO; X6: activity of PAL; X7: expression of PAL. **: correlation is significant at the 0.01 level, *: correlation is significant at the 0.05 level.

3 討論

外植體褐變是組織培養(yǎng)初期面臨的主要問(wèn)題之一，有研究表明黑暗或者較低光照強(qiáng)度有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但不利于愈傷組織的生長(zhǎng)[17-18]，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，愈傷組織在黑暗或弱光條件下呈乳白色或淡黃色可能由于某些生長(zhǎng)相關(guān)的內(nèi)源激素或色素的合成受到了抑制。增加光照強(qiáng)度會(huì)提高相關(guān)酶的活性，促進(jìn)植物組織培養(yǎng)中多種酚類物質(zhì)的氧化導(dǎo)致褐化程度加強(qiáng)[19]。這與酚類物質(zhì)的合成和氧化相關(guān)的酶是光誘導(dǎo)型的有關(guān)[20]，而酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)是導(dǎo)致褐化的最直接原因之一[21]。

試驗(yàn)過(guò)程中未檢測(cè)到?jīng)]食子酸和兒茶酚，可能因?yàn)闆](méi)食子酸和兒茶酚在葡萄愈傷組織中含量極低或不存在。綠原酸含量與褐化程度呈顯著正相關(guān)，綠原酸的大量積累可能是造成葡萄愈傷組織褐變的一個(gè)重要因素，這與前人研究綠原酸是鮮切荸薺的主要褐變底物結(jié)果一致[22-23]；對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、香豆酸含量與褐化程度有密切關(guān)系，且隨著褐化程度的增加對(duì)羥基苯甲酸的含量顯著降低，這可能是因?yàn)閷?duì)羥基苯甲酸是導(dǎo)致褐變的酚氧化酶的主要作用底物。褐化前后阿魏酸的含量變化不明顯表明阿魏酸對(duì)愈傷組織褐化影響不大。

在1 000?1 500 Lx光照強(qiáng)度處理下愈傷組織誘導(dǎo)率較高，褐化程度較輕且生長(zhǎng)勢(shì)較好，這可能由于在該光照強(qiáng)度范圍內(nèi)尚未完全激活、和活性基因的表達(dá)，引起褐變的主要作用酶活性較小，故褐化程度較弱。當(dāng)光照強(qiáng)度高于1 500 Lx時(shí)愈傷組織的褐化程度增加，此時(shí)PPO和PAL酶活性與酶基因的表達(dá)量均與褐化率呈極顯著正相關(guān)。表明和酶基因上調(diào)表達(dá)可以顯著提高PPO和PAL酶活性，PPO和PAL酶活性增強(qiáng)可能是引起愈傷組織褐變的主要原因，這與前人研究結(jié)果基本一致[24]，但和酶基因是否直接參與了誘導(dǎo)褐變的發(fā)生，其作用仍有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

光照強(qiáng)度是影響葡萄愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)重要的外界環(huán)境因子，較高的光照強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)率下降、褐化率增加；光照強(qiáng)度較低會(huì)影響愈傷組織生長(zhǎng)情況。本試驗(yàn)條件下葡萄愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)的適宜光照強(qiáng)度為1 000?1 500 Lx。

[1] Yao HJ, Luo XF, Tian YT. Development of explant browning researches. J Beijing Forest Univ, 1999, 21(3): 79–84 (in Chinese).姚洪軍, 羅曉芳, 田硯亭. 植物組織培養(yǎng)外植體褐變的研究進(jìn)展. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 21(3): 79–84.

[2] Zhou JH, Zhou JR, Zeng HS, et al. Advance of studies on browning and antibrowning techniques in the tissue culture of horticultural plants. Acta Horticult Sin, 2000, 27(Suppl): 481–486 (in Chinese).周俊輝, 周家容, 曾浩森, 等. 園藝植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào), 2000, 27(增刊): 481–486.

[3] Yang H, Xiulian G, Ran L, et al. Changes in morphology and biochemical indices in browning callus derived from Jatropha curcas hypocotyls. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2009, 98(1): 11–17.

[4] Peter WT, Ian BD. Polyphenol oxidase in potato. Plant Physiol, 1995, 109(2): 525–531.

[5] Li XF, Gong ZH, Sun DQ, et al. The comparison of physiological indexes and the relation with browning in tissue culture about different peony species. Acta Agr Boreali-occidentalis Sin, 2008, 17(1): 142–145 (in Chinese).李新鳳, 鞏振輝, 孫冬青, 等. 不同品種牡丹幾個(gè)生理參數(shù)的比較及其與組培中褐化的關(guān)系. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(1): 142–145.

[6] Xu CJ, Li L. Changes of total phenol content and the activities of PPO, POD and PAL during the browning in phalaenopsis explant. Acta Horticult Sin, 2006, 33(3): 671–674 (in Chinese).許傳俊, 李玲. 蝴蝶蘭外植體褐變發(fā)生與總酚含量、PPO、POD和PAL的關(guān)系. 園藝學(xué)報(bào), 2006, 33(3): 671–674.

[7] Coetzer C, Corsini D, Love S, et al. Control of enzymatic browning in potato (L.) by sense and antisense RNA from tomatopolyphenol oxidase. Agr Food Chem, 2001, 49 (2): 652–657.

[8] Liu LM, Liu HY, Tian BM. Analysis of POD activity and gene expression pattern in sesame infected with. J Henan Agr Sci, 2012, 41(8): 93–98 (in Chinese).劉莉銘, 劉紅彥, 田保明. 莖點(diǎn)枯病菌誘導(dǎo)后芝麻過(guò)氧化物酶活性變化及其基因表達(dá)分析. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 41(8): 93–98.

[9] Xu CJ, Li H, Li L. Phenylalanine ammonialyase () gene expression correlated withsp. leaf explant browning. J Trop Subtrop Bot, 2007, 15(1): 50–54 (in Chinese).許傳俊, 李紅, 李玲. 蝴蝶蘭葉片外植體褐變過(guò)程中基因的表達(dá)變化. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2007, 15(1): 50–54.

[10] Hisaminato H, Murata M, Homma S. Relationship between theenzymatic browning and phenylalanine ammonia-lyase activity of cut lettuce, and the prevention of browning by inhibitors of polyphenol biosynthesis. Biosci Biotech Biochem, 2001, 65:1016–1021.

[11] Yu C, Yang X, Wang ZH, et al. Research on preparation method of protoplasts from callus of grape. J Fruit Sci, 2013, 30(3): 433–436 (in Chinese).俞超, 楊瀟, 王忠華, 等. 葡萄愈傷組織制備原生質(zhì)體的影響因素研究. 果樹學(xué)報(bào), 2013, 30(3): 433–436.

[12] Lü HT, Sun HF, Qu BH, et al. Smiultaneous determ ination of six phenolic compounds in apple juice by high performance liquid chromatography. Chin J Anal Chem, 2007, 35(10): 1425–1429 (in Chinese).呂海濤, 孫海峰, 曲寶涵, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蘋果汁中6種酚類物質(zhì). 分析化學(xué), 2007, 35(10): 1425–1429.

[13] Wei JM, Zhu XQ, Liu CJ, et al. Changes of LOX, PPO and POD activities in sweet cherry fruit and effects of postharvest treatment on their activities. J Hebei Agr Sci, 2010, 14(1): 25–28, 60 (in Chinese).魏建梅, 朱向秋, 劉長(zhǎng)江, 等. 甜櫻桃果實(shí)LOX、PPO和POD活性變化特性及采后處理效應(yīng). 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 14(1): 25–28, 60.

[14] Zhen XL, Tian SP, Li BQ, et al. Changes in antioxidant systems and polyphenol oxidase activity in peach fruit treated with exogenous oxalic acid during storage at low temperature. Acta Horticul Sin, 2005, 32(5): 788–792 (in Chinese).鄭小林, 田世平, 李博強(qiáng), 等. 草酸對(duì)冷藏期間桃果實(shí)抗氧化系統(tǒng)和PPO活性的影響. 園藝學(xué)報(bào), 2005, 32(5): 788–792.

[15] Wang Y, Xie H, Zhang ZQ, et al. Relationship between chilling injury of banana fruit stored at low temperature and PAL activity and soluble proteins. J Fruit Sci, 2004, 21(2): 149–152 (in Chinese).王勇, 謝會(huì), 張昭其, 等. 香蕉果實(shí)貯藏冷害與PAL活性及可溶性蛋白的關(guān)系. 果樹學(xué)報(bào), 2004, 21(2): 149–152.

[16] Mei Z, Ping L, Guanglian Z, etal. Cloning and functional analysis of() genes encoding a key enzyme during abscisicacid biosynthesis from peach and grape fruits. J Plant Physiol, 2009, (166): 1241–1252.

[17] Ge FJ, Liu BY, Lu ZY, et al. Effects of light intensity on growth and phenolic contents of. Environ Sci Technol, 2012, 35(3): 30–34 (in Chinese).葛芳杰, 劉碧云, 魯志營(yíng), 等. 穗花狐尾藻生長(zhǎng)及酚類物質(zhì)含量對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)研究. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2012, 35(3): 30–34.

[18] Liu HK, Han MY, Yu T, et al. Factors affecting embryonic callus from leaves of early season nectarine cultivars. J Fruit Sci, 2006, 23(3): 370–374 (in Chinese).劉航空, 韓明玉, 禹婷, 等. 影響油桃葉片產(chǎn)生胚性愈傷組織的因素. 果樹學(xué)報(bào), 2006, 23(3): 370–374.

[19] Scondahl MMR, Monaco LC, Sharp WR.methods applied to coffee//Trevor AT horpe Ed. Plant Tissue Culture Methods and Application in Agriculture. New York: Academic Press, 1981: 325–348.

[20] Marks TR, Simpson SE. Reduced phenolic oxidation at culture initia-tionin vitrofollowing the exposure of field-grown stock-plants to dark-ness or low level of irradiance. Hort Sci, 1990, 65: 103–111.

[21] Scorza R, Cordts JM, Gray DJ. Producing transgenic ‘Tompson Seedless’. J Amer Soc Hort Sci, 1996, 121(4): 616–619.

[22] Loaiza-Velarde JG, Mangrich ME, Campos-Vargas R, etal. Heat shock reduces browning of resh-cut celery petioles. Postharvest Biol Technol, 2003, 27(3): 305–311.

[23] Yin F, Ge H, Peng KQ, et al. The influence of phenols on tissue browning of. Acta Horticult Sin, 2006, 33(5): 1137–1140 (in Chinese).印芳, 葛紅, 彭克勤, 等. 酚類物質(zhì)與蝴蝶蘭褐變關(guān)系初探. 園藝學(xué)報(bào), 2006, 33(5): 1137–1140.

[24] Jiang CC, Chen GX, Pan DM, et al. Expression of three polyphenol oxidases during vegetative and reproductive development and in response to wounding in the prunus salicina. Acta Horticul Sin, 2012, 39(2): 363–369 (in Chinese).姜翠翠, 陳桂信, 潘東明, 等. 生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和受機(jī)械損傷后基因的表達(dá). 園藝學(xué)報(bào), 2012, 39(2): 363–369.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effects of light intensity on associated enzyme activity and gene expression during callus formation of

Rong Liu1, Guowei Yang1, Yueyan Wu1, Huiyun Rao1, Xuefu Li1,2, Meiqin Li1,2, and Pingxian Qian1

1College of Biology and Environment Sciences,Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100,Zhejiang, China 2College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

We analyzed the best light intensity for callus induction and maintenance inand explored the mechanism of grape callus browning. Tender stem segments of grape cultivar “gold finger” were used to study the effects of different light intensities (0, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000 and 4 000 Lx) on the induction rate, browning rate and associated enzyme activity and gene expression duringcallus formation. The callus induction rate under 0, 500, 1 000 and 1 500 Lx was more than 92%, significantly higher than in other treatments (< 0.05). A lower browning rate and better callus growth were also observed during subculture under 1 000 and 1 500 Lx treatments. We found that chlorogenic acid, caffeic acid,-hydroxybenzoic acid and coumaric acid contents were correlated with the browning rate of callus, among which chlorogenic acid content was positively correlated with the browning rate (< 0.05). Peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) activities were negatively correlated with the browning rate of callus (< 0.01). The,andphenylalanine ammonialyase () expression levels were positively correlated with the browning rate at< 0.05 or< 0.01. An appropriate light intensity for the tissue culture ofwas 1 000?1 500 Lx, higher or lower light intensities significantly impaired normal callus growth.

, callus, light intensity, induction rate, browning rate, enzyme activity, gene expression

10.13345/j.cjb.140494

October 20, 2014; Accepted:December 1, 2014

Science and Technology Innovation Team of Ningbo City (No. 2013C24002), Science and Technology Department of Zhejiang Province (No. 2011B82019), Major Science and Technology of Ningbo City (No. 2015C110016).

Yueyan Wu. Tel: +86-574-88222235; E-mail: wyynb2009@163.com

浙江省科技廳項(xiàng)目(No. 2013C24002)，寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No. 2011B82019)，寧波市重大科技專項(xiàng) (No. 2015C110016) 資助。

2015-05-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150513.1529.001.html