廖聲友，王翠華，湯冬娥，魏金梅，賀玉嬌，熊海庭，徐鳳梅，高學(xué)娟，劉小會(huì)，劉朗夏

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FlightlessⅠ與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importin β及核孔蛋白Nup88的相互作用

廖聲友，王翠華，湯冬娥，魏金梅，賀玉嬌，熊海庭，徐鳳梅，高學(xué)娟，劉小會(huì)，劉朗夏

廣東省高校功能蛋白質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632

廖聲友, 王翠華, 湯冬娥, 等. FlightlessⅠ與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importin β及核孔蛋白Nup88的相互作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1247–1254.Liao SY, Wang CH, Tang DE, et al. Interaction of FlightlessⅠwith Nup88 and Importin β. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1247–1254.

Fightless I (FLII) 是一個(gè)在腫瘤中高表達(dá)的蛋白，前期研究提示FLII可能參與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，為鑒定FLII是否與核膜結(jié)合蛋白相互作用，構(gòu)建GST-FLII、GST-LRR融合蛋白重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使用GST瓊脂糖珠進(jìn)行融合蛋白的純化。通過SDS-PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行驗(yàn)證之后，利用GST-pull down及免疫共沉淀技術(shù)證明了FLII與Importin β、Nup88蛋白的相互作用，并鑒定FLII上的LRR結(jié)構(gòu)域?yàn)橄嗷プ饔脜^(qū)域。研究結(jié)果提示FLII可能參與了Importin β的部分生物學(xué)作用，為進(jìn)一步分析FLII與Importin β、Nup88的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

分子生物學(xué)，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)，GST-pull down，免疫共沉淀，F(xiàn)lightlessⅠ，Importin β，Nup88

核孔復(fù)合物是貫穿于核膜上作為細(xì)胞核質(zhì)物質(zhì)交換的主要通道，由不同的核孔蛋白形成巨大的蛋白復(fù)合體，跨雙層脂質(zhì)核膜。近年來，核孔蛋白復(fù)合體蛋白88 (Nup88) 在人卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌腫瘤邊緣等其他惡性腫瘤中過度表達(dá)，在胃癌肝癌等實(shí)體瘤中也呈高表達(dá)，而在對(duì)應(yīng)的正常組織中則表達(dá)較弱，提示其與腫瘤的侵襲及形成能力密切相關(guān)[1-5]，目前Nup88已被提議作為一種腫瘤標(biāo)志物[2]。Importin β家族蛋白作為最主要的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體，在真核生物中分布廣泛。Importin家族成員的N端可以結(jié)合RanGTP[6]、中部結(jié)合核孔蛋白 (Nups)[7]、C端結(jié)合底物 (Cargo)[8]或接頭蛋白 (Adaptor)[9]，從而將底物帶入或帶出細(xì)胞核。Importin β家族蛋白在核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起到了極其重要的作用，因此Importin β家族蛋白本身的表達(dá)調(diào)控也成為了調(diào)節(jié)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的一種重要方式。

FlightlessⅠ(FLII) 蛋白包含N端15個(gè)重復(fù)的LRR (Leucine-rich repeat) 結(jié)構(gòu)域和C端5個(gè)重復(fù)的GLD (Gelsolin-like repeat) 結(jié)構(gòu)域[10]。LRR結(jié)構(gòu)域是蛋白與蛋白，蛋白與DNA/RNA相互作用的區(qū)域，與Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[11-12]，而GLD結(jié)構(gòu)域主要與actin相關(guān)[13]，然而兩種結(jié)構(gòu)對(duì)于結(jié)合多種核受體蛋白起轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)作用是必要的[14-20]。前期研究發(fā)現(xiàn)FLII是一個(gè)癌癥相關(guān)蛋白，F(xiàn)LII的相互作用組學(xué)提示FLII與多種核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，并鑒定到兩個(gè)關(guān)鍵的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nup88和Importin β，說明FLII可能在核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起調(diào)節(jié)作用，或參與其部分生物學(xué)功能。早期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LII參與胚胎發(fā)育[21]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)激[12-14,18,22-27]等過程，并具有與核激素受體(NR)協(xié)同NCOA2和CARM1一起發(fā)揮作用而激活轉(zhuǎn)錄等功能[14]。然而FLII作為一種核激素受體蛋白，其在轉(zhuǎn)錄后的相關(guān)功能及作用機(jī)制尚未清楚，對(duì)FLII是否與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importin β、核孔蛋白Nup88相互作用，及是否調(diào)節(jié)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究通過GST-pull down及免疫共沉淀技術(shù)證明了FLII與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importin β、核孔蛋白Nup88相互作用，并發(fā)現(xiàn)LRR結(jié)構(gòu)域在其相互作用過程中起重要作用。為進(jìn)一步研究FLII是否調(diào)節(jié)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程及三者之間的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌細(xì)胞H1299購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1由實(shí)驗(yàn)室保存。FLII cDNA購于長沙贏潤生物科技公司。瓊脂糖粉購于美國Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶 (HⅠ，Ⅰ)、T4 DNA連接酶、DNA Polymerase、DNA marker購于TaKaRa公司。凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根公司。Importin β，F(xiàn)lightlessⅠ抗體購于Santa Cruz公司。HRP偶聯(lián)鼠二抗購于Protein Tech Group公司。胎牛血清購于德國PAA公司。DMEM完全培養(yǎng)基購于Gibco公司。GST瓊脂糖珠購于GE Healthcare公司。IPTG、預(yù)染蛋白marker和R250，G250染色試劑盒購自斯佳生物公司。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T-1-FLII、pGEX-4T-1-LRR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索人FlightlessⅠ基因CDS序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)FlightlessⅠ全長與LRR結(jié)構(gòu)域片段引物。通過基因序列分析選擇上游引物酶切位點(diǎn)為HⅠ，下游引物酶切位點(diǎn)為Ⅰ。引物序列如表1所示，由Invitrogen公司合成。以FLII cDNA載體為模板利用引物PCR擴(kuò)增FLII基因及LRR片段，將擴(kuò)增的片段用HⅠ與Ⅰ雙酶切后克隆至同樣酶切的pGEX-4T-1載體中，用T4 DNA連接酶連接目的片段與載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后用抗性篩選陽性克隆，并以雙酶切法進(jìn)行鑒定。選取雙酶切正確的陽性克隆送至Invitrogen公司測序。

表1 GST-FLII及GST-LRR載體構(gòu)建引物序列

Restriction sites were underlined. F: forward primer; R: reverse primer.

1.2.2 GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白的純化、Western blotting鑒定

將GST融合蛋白質(zhì)粒及表達(dá)GST的空載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐抗生素的平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，將其接種于10 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，第2天，按1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)600吸光值達(dá)到0.6?0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為 0.2 mmol/L，室溫誘導(dǎo)4?6 h；離心收集菌體，加入含有蛋白酶抑制劑的EBC 裂解液冰上裂解菌體10 min，再進(jìn)行超聲破碎20 min，4 ℃離心收集上清，加入DTT 至終濃度1 mmol/L。按照GE公司GST Fusion Protein Spin Purification Kit說明書，0.5 mL的GST珠子懸液，靜置 30 min，待其完全沉降后，10倍體積的PBS清洗純化柱，將裂解上清過柱，10倍體積的清洗緩沖液清洗純化柱，然后3倍柱體積洗脫緩沖液洗脫蛋白，利用SDS-PAGE及后續(xù)的Western blotting分析蛋白的純化情況。

1.2.3 GST-pull down檢測FLII、LRR與Importin β、Nup88的相互作用

H1299細(xì)胞經(jīng)EBC裂解液 (含0.5 mmol/L PI、1 mmol/L PMSF) 冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清并用BCA法測定蛋白濃度，將純化的GST融合蛋白與H1299全細(xì)胞裂解液混合，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，用EBC裂解液清洗珠子5次，向所得樣品中加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min后進(jìn)行Western blotting檢測結(jié)合蛋白。

1.2.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

H1299細(xì)胞中加入EBC裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，裂解后12 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清后加入IgG和Protein A/G plusAgarose進(jìn)行預(yù)洗，BCA法測定蛋白濃度后將H1299細(xì)胞裂解液分成2份，每份1 mg蛋白量。以IgG抗體作為陰性對(duì)照，Importin β抗體為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞裂解液與抗體4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，18 h后加Protein A/G 瓊脂糖珠孵育4 h，用EBC裂解液清洗珠子5次，向樣品中加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE、Western blotting檢測結(jié)合蛋白。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-4T-1-LRR、pGEX-4T-1-FLII載體的構(gòu)建

PCR的目的片段雙酶切后克隆至pGEX-4T-1載體中，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化等步驟篩選陽性克隆，將陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示LRR酶切片段長度約1 500 bp，F(xiàn)LII酶切片段長度約3 800 bp，見圖1和圖2。表明目的片段LRR (圖1) 和FLII (圖2) 已成功克隆至載體pGEX-4T-1中。選取雙酶切正確的LRR質(zhì)粒1號(hào)及FLII質(zhì)粒2號(hào)進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫FlightlessⅠ基因及LRR片段完全匹配，證明pGEX-4T-1-LRR、pGEX-4T-1-FLII質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pGEX-4T-1-LRR載體雙酶切鑒定

圖2 pGEX-4T-1-FLII載體雙酶切鑒定

2.2 GST、GST-FLII、GST-LRR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的GST標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)化到Rosetta菌株里，IPTG誘導(dǎo)菌株表達(dá)GST融合蛋白，收集菌體超聲破碎裂解細(xì)胞，經(jīng)過過柱純化洗脫等步驟，使用SDS-PAGE檢測純化效果，蛋白電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果見圖3、4。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物在26 kDa出現(xiàn)了一條明顯的GST蛋白條帶 (圖3，泳道2)，并成功將GST蛋白純化 (圖3，泳道5)。同樣的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物在172 kDa和83 kDa分別出現(xiàn)了明顯的GST融合蛋白條帶 (圖4，泳道2和10)，并經(jīng)過純化等步驟也成功將GST-FLII (圖4，泳道6) 和GST-LRR (圖4，泳道14) 融合蛋白純化。表明GST及GST融合蛋白已經(jīng)成功誘導(dǎo)并純化。

圖3 GST蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

圖4 GST-FLII與GST-LRR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 GST-pull down驗(yàn)證LRR、FLII與Nup88、Importin β的相互作用

為驗(yàn)證GST-LRR、GST-FLII與Nup88、Importin β是否直接相互作用，使用純化的GST蛋白和GST-LRR、GST-FLII融合蛋白分別和H1299的全細(xì)胞裂解液混合并低溫孵育過夜，通過蛋白相互作用的特異性結(jié)合，獲得與GST-LRR、GST-FLII相互作用的蛋白復(fù)合物，并進(jìn)行Western blotting分析。使用Nup88抗體檢測結(jié)果顯示，在GST對(duì)照中無Nup88蛋白條帶存在，而在GST-LRR、GST-FLII中有明顯的Nup88蛋白條帶存在，使用Importin β抗體檢測結(jié)果顯示在對(duì)照中沒有Importin β蛋白條帶，在GST-LRR與GST-FLII中都有Importin β蛋白條帶，見圖5。結(jié)果表明GST-LRR與GST-FLII 能特異性地與Nup88、Importin β蛋白結(jié)合。因此驗(yàn)證FLII和Nup88、Importin β蛋白存在特異性的相互作用，并且LRR結(jié)構(gòu)域作為相互作用結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其可以獨(dú)立地與Nup88、KPNB1蛋白相互作用。

圖5 GST-pull down驗(yàn)證LRR、FLII與Nup88、Importin β的相互作用

2.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Importin β與 FLII的相互作用

為了進(jìn)一步確認(rèn)在細(xì)胞正常生理狀態(tài)下FLII和Importin β存在相互作用，運(yùn)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。用Importin β抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，IgG為陰性對(duì)照，分別與H1299全細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育，通過Protein A/G瓊脂糖珠沉淀相互作用蛋白復(fù)合體，并進(jìn)行Western blotting分析。檢測結(jié)果如圖6所示，Importin β抗體檢測到免疫沉淀中具有Importin β蛋白，說明免疫沉淀Importin β實(shí)驗(yàn)正確，同時(shí)用FLII抗體在免疫沉淀Importin β的樣品中檢測到有明顯的共沉淀FLII蛋白條帶存在，結(jié)果表明內(nèi)源Importin β與FLII存在特異的相互作用，與GST-pull down結(jié)果相一致。

圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Importin β和FLII的相互作用

3 討論

FlightlessⅠ (FLII) 蛋白含有1 256個(gè)氨基酸，分子量為145 kDa，是一個(gè)高度保守的蛋白，編碼包括C-端肌動(dòng)蛋白結(jié)合的類凝溶膠蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域 (GEL domain) 和N-端富含亮氨酸重復(fù)的蛋白與蛋白結(jié)合區(qū)域 (LRRs domain)[28-31]。然而兩種結(jié)構(gòu)對(duì)于結(jié)合多種核受體蛋白起轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)作用是必要的[14-20]。已有相關(guān)文獻(xiàn)證明FLII參與基因的轉(zhuǎn)錄起始，通過蛋白相互作用直接或間接調(diào)節(jié)結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性[16,32]。FLII蛋白在癌細(xì)胞中高表達(dá)[33]，而在正常組織中相對(duì)表達(dá)較弱，表明FLII在癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。研究中利用GST-pull down及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)FLII與Nup88及Importin β具有特異性的相互作用，首先純化出GST-FLII蛋白及其相互作用結(jié)構(gòu)域GST-LRR蛋白，并與H1299全細(xì)胞裂解液進(jìn)行沉淀。結(jié)果顯示，F(xiàn)LII與Nup88及Importin β都有相互作用，并且發(fā)現(xiàn)LRR作為相互作用結(jié)構(gòu)域可以單獨(dú)與Nup88及Importin β蛋白相互作用。Importin β免疫共沉淀H1299全細(xì)胞裂解液，結(jié)果顯示，Importin β與FLII蛋白在細(xì)胞內(nèi)也存在特異性的相互作用。其三者的相互作用與前期蛋白相互作用組學(xué)結(jié)果相一致，表明FLII可能參與了Nup88及Importin β的部分生物學(xué)功能。

FLII的質(zhì)譜相互作用組學(xué)鑒定提示FLII與多種核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白有聯(lián)系，F(xiàn)LII作為一種既可以與Importin β結(jié)合又可以與核孔蛋白Nup88結(jié)合的相互作用蛋白，在體內(nèi)可能參與二者在核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的功能，然而FLII作為一種核激素受體蛋白是否具有核轉(zhuǎn)運(yùn)功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Nup88作為一種惡性腫瘤的分子標(biāo)志物，而Importin β在腫瘤中具有調(diào)控作用，因此研究FLII蛋白與Nup88、Importin β的分子作用機(jī)制具有重要意義。本研究證明FLII與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有特異性的相互作用，并發(fā)現(xiàn)LRR可以單獨(dú)行使其與Nup88及Importin β之間的相互作用功能。為研究FLII與Nup88、Importin β三者在體內(nèi)的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，研究結(jié)果為進(jìn)一步分析FLII與Nup88、Importin β三者的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Interaction of Flightless I with Nup88 and Importin β

Shengyou Liao, Cuihua Wang, Dong’e Tang, Jinmei Wei, Yujiao He, Haiting Xiong, Fengmei Xu, Xuejuan Gao, Xiaohui Liu, and Langxia Liu

,,,510632,,

High expression of Fightless I (FLII) is associated to multiple tumors. Based on our previous study that FLII might be involved in the nuclear export, we assessed the possible interaction of FLII with the nuclear envelop associating proteins Importin β and Nup88. We first constructed GST-FLII, GST-LRR recombinant plasmids and transformed them into the Rosetta strain to produce GST-FLII, GST-LRR fusion protein. After purification of these proteins, GST-pull down, as well as co-immunoprecipitation, were used to test the interaction of FLII with Importin β and Nup88. FLII interacted with Importin β and Nup88, and FLII LRR domain is responsible for these interactions. Thus, FLII may play a role in nuclear export through interaction with Importin β and Nup88.

molecular biology, RNA traffic, GST-pull down, CO-IP, FlightlessⅠ, Importin β, Nup88

10.13345/j.cjb.150047

January 23, 2015; Accepted:April 30, 2015

Langxia Liu. Tel: +86-20-85222573; E-mail: langxialiu@gmail.com, tliulx@jnu.edu.cn.

2015-05-26

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150526.1645.001.html