李泰明，潘俊杰，祁靜，張春

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昆蟲(chóng)細(xì)胞制備AAV-ITR基因表達(dá)微載體

李泰明1，潘俊杰1，祁靜2，張春2

1 中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009 2 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所蘇州市分子診斷和治療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215163

李泰明, 潘俊杰, 祁靜, 等. 昆蟲(chóng)細(xì)胞制備AAV-ITR基因表達(dá)微載體. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1230–1238.Li TM, Pan JJ, Qi J, et al. Preparation of a novel AAV-ITR gene expression mini vector in Sf9 insect cells via baculovirus. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1230–1238.

AAV-ITR基因表達(dá)微載體是只含有腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus, AAV) 倒置末端重復(fù)序列 (Inverted terminal repeats, ITR)、基因表達(dá)順式元件和目的基因，而不含有其他外源DNA序列的雙鏈或單鏈DNA。本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，制備得到兩種重組桿狀病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep，并將二者的P3代病毒共同感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Spodoptera frugiperda (Sf9)，抽提小分子量DNA，獲得AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體，2×107的Sf9細(xì)胞抽提可以得到100 μg AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體，核酸電泳顯示AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體主要以單體和二聚體的形式存在。將AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體通過(guò)polyethylenimine (PEI) 轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡觀察有EGFP表達(dá)，48 h后達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到65%。

基因治療，基因表達(dá)微載體，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，非病毒載體

基因治療是人類治療腫瘤、傳染病、遺傳病的發(fā)展方向?；蛑委熞揽哭D(zhuǎn)染性高、安全有效的基因載體，尋找安全有效的基因治療載體是當(dāng)今基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，應(yīng)用于基因治療的載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒基因表達(dá)載體是用于基因治療的主要基因表達(dá)載體，但是病毒載體由于其蛋白質(zhì)組成成分以及DNA組成成分，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明易引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、細(xì)胞炎癥，而且存在插入突變、致癌等風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。非病毒載體通常使用細(xì)菌質(zhì)粒DNA (pDNA) 將外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中，除了導(dǎo)入目的基因外，還會(huì)包含篩選和擴(kuò)增質(zhì)粒所必需的DNA 序列[4-6]，比如抗生素抗性基因 (-內(nèi)酰胺類) 以及增殖復(fù)制的起始子 (,)，造成機(jī)體免疫反應(yīng)、細(xì)胞炎癥、細(xì)胞毒性等不良副作用。目前，針對(duì)pDNA的改造有制備成微環(huán)DNA (Mini-circle DNA) 和線性共價(jià)閉合微環(huán)DNA (Mini-linear covalently closed, mini-lcc)[7-9]。二者都是盡可能刪除潛在的會(huì)引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)以及干擾載體整合效率的序列。Chen[11-12]課題組對(duì)基因表達(dá)微載體表達(dá)外源基因的機(jī)理進(jìn)行的研究表明，外源基因序列以及CpG的存在會(huì)引起外源基因的表達(dá)沉默化，而基因表達(dá)微載體中的外源基因則能長(zhǎng)久表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)制備得到的AAV-ITR基因表達(dá)微載體是一種基于腺相關(guān)病毒倒置末端重復(fù)序列的基因表達(dá)載體，僅含有AAV基因組的兩端的ITR序列和中間的基因表達(dá)框序列。前期實(shí)驗(yàn)[13]中采用熱變性的方法制備了AAV-ITR單鏈微載體，在細(xì)胞內(nèi)得到了有效表達(dá)。近期有研究者證實(shí)在一個(gè)閱讀框架中同時(shí)表達(dá)AAV復(fù)制蛋白R(shí)ep78和Rep52，能使Rep蛋白表達(dá)量提高，從而增加AAV基因組的復(fù)制[14]。本研究在其基礎(chǔ)上，合理改進(jìn)桿狀病毒載體，將基因中插入一段人工合成的內(nèi)含子序列，該序列中含有桿狀病毒晚期啟動(dòng)子ph，得到的桿狀病毒Bac-inrep感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后能在一個(gè)閱讀框架中同時(shí)表達(dá)Rep78和Rep52，提高了Rep78和Rep52的表達(dá)，增加了AAV基因組的復(fù)制。將含有ITR及EGFP表達(dá)框的序列構(gòu)建到另外一個(gè)桿狀病毒Bac-ITR-EGFP中，共同感染Sf9細(xì)胞，制備AAV-ITR基因表達(dá)微載體。

1 材料與方法

1.1 材料

AAV-MCS質(zhì)粒、pFastbBacdual質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司。Sure 2感受態(tài)、pUC57- minivector、pAAV-in-RC質(zhì)粒、DH10 Bac感受態(tài)、Sf9細(xì)胞、HEK 293T細(xì)胞均為中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所細(xì)胞分子生物學(xué)研究中心保存。限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ購(gòu)自Thermo Scientific。其余限制性內(nèi)切酶以及T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB。購(gòu)自TOYOBO。小鼠抗人AAV-rep單克隆抗體購(gòu)自American Research Products。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L) 購(gòu)自海門(mén)碧云天。Cycle-pure kit試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA。Sf-900 II SFM、Cellfectin II reagent、Fetal bovine serum、Antibiotic-Antimycotic (100×) 購(gòu)自Invitrogen公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純以上。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pFastBacdual-ITR-EGFP質(zhì)粒

腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS用Ⅰ和Ⅰ雙酶切得到目的片段，桿狀病毒載體 pFastBacdual用Ⅰ和Ⅰ雙酶切得到載體片段，分別用1%瓊脂糖電泳，膠回收。目的片段和載體片段在T4 DNA連接酶的作用下，16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單克隆經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，通過(guò)Ⅰ單切鑒定該重組質(zhì)粒并測(cè)序。

以質(zhì)粒pUC57-minivector為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增EGFP序列 (約720 bp)。引物分別為P1和P2，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，64.3 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。用HⅠ和Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物和pFastBacdual-ITR載體，用Cycle-pure kit試劑盒純化后用T4 DNA連接酶，16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單克隆經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，用HⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定該重組質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.2 構(gòu)建pFastBacdual-inrep質(zhì)粒

以pAAV-in-RC[15]為模板，P3和P4為引物，PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 3 min，PCR 擴(kuò)增得到inrep。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳膠回收。Z17Ⅰ和Ⅰ雙酶切PCR回收產(chǎn)物。pFastBacDual用Ⅰ和Ⅰ雙切。PCR片段酶切產(chǎn)物與載體片段用Cycle-pure kit試劑盒回收，T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)，挑取單克隆經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，通過(guò)I酶切鑒定該重組質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的pFastBacdual-inrep、pFastBacdual-ITR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有Bacmid和helper質(zhì)粒的DH10 Bac感受態(tài)，藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，抽提重組Bacmid。用M13通用引物P5和P6，PCR鑒定Bacmid-inrep，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃30 s，68 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)。用M13上游引物P5和EGFP下游引物P7，PCR鑒定 Bacmid- ITR-EGFP，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。

表1 PCR引物序列

1.2.4 重組桿狀病毒的獲取

將鑒定正確的Bacmid-inrep、Bacmid- ITR-EGFP用Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染六孔板中的Sf9細(xì)胞，細(xì)胞密度為50%–60%，120 h后收集培養(yǎng)上清 (1 450 r/min, 5 min) 得到的上清即為P1。取P1按 MOI值0.1連續(xù)感染Sf9細(xì)胞兩次后獲得高滴度的P3病毒，噬菌斑法測(cè)病毒滴度。

1.2.5 桿狀病毒表達(dá)Bac-inrep蛋白的鑒定

取重組桿狀病毒Bac-inrep P3 (MOI=5) 感染六孔板中的Sf9細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，離心 (1 450 r/min, 5 min)，用PBS洗兩遍。細(xì)胞沉淀裂解后，上清用于Western blotting檢測(cè)。濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%。一抗為小鼠抗人AAV-rep單克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)。

1.2.6 制備AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體

當(dāng)Sf9細(xì)胞處于指數(shù)增長(zhǎng)期至2×106cells/mL時(shí)，按MOI=2加入兩種重組桿狀病毒 Bac-inrep P3和Bac-ITR-EGFP P3。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收取Sf9細(xì)胞。抽提Sf9中的小分子量的DNA，用Ⅰ酶切鑒定。

1.2.7 AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體在體外細(xì)胞中的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK 293T細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至較好狀態(tài)時(shí)(密度為2.5×105cells/mL)。基因表達(dá)微載體DNA用PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞，N/P比為15，將PEI-DNA混合液加入至用PBS溶液清洗過(guò)的HEK 293T細(xì)胞表面，再加入適量培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后熒光顯微鏡下觀察，流式細(xì)胞儀測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與桿狀病毒的制備

在質(zhì)粒pFastBacdual上插入含有AAV-ITR基因表達(dá)框的序列，得到重組質(zhì)粒pFastBacdual- ITR，Ⅰ單切鑒定得到4 997 bp、1 277 bp、666 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1A，與預(yù)期條帶一致，測(cè)序結(jié)果正確。以重組質(zhì)粒pFastBacdual-ITR 為載體，插入報(bào)告基因EGFP，得到重組質(zhì)粒pFastBacdual-ITR-EGFP (圖1B)，用HⅠ和Ⅰ雙酶切得到6 905 bp、726 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1C，與預(yù)期條帶一致，測(cè)序結(jié)果正確。

參照Chen[15]的構(gòu)建方法，構(gòu)建rep表達(dá)質(zhì)粒，為的啟動(dòng)子，為的啟動(dòng)子(圖2A)。在質(zhì)粒pFastBacdual上插入得到重組質(zhì)粒pFastBacdual-inrep，Ⅰ單切鑒定得到7 375 bp條帶，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2B，與預(yù)期條帶一致，測(cè)序結(jié)果正確。

圖1 pFastBacdual-ITR-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖2 Bac-inrep的基因轉(zhuǎn)錄示意圖與pFastBacdual-inrep質(zhì)粒的鑒定

將上述兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH 10Bac感受態(tài)，藍(lán)白篩選得到Bacmid-inrep、Bacmid- ITR-EGFP。通過(guò)PCR進(jìn)一步篩選正確桿粒。以Bacmid-inrep為模板，P5和P6為引物做PCR擴(kuò)增，鑒定重組桿狀病毒DNA。結(jié)果顯示，重組Bacmid-rep在5 000 bp附近有目的條帶 (圖3A)，與預(yù)計(jì)的結(jié)果 (4 760 bp) 一致。以Bacmid-ITR-EGFP為模板，以P5和P7為引物做PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示重組Bacmid-ITR-EGFP在2 000–3 000 bp附近有目的條帶 (圖3B)，與預(yù)計(jì)的結(jié)果 (2 151 bp) 一致。重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞得到病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep。

2.2 Rep蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)

用小鼠抗人AAV-rep單克隆抗體的單克隆抗體檢測(cè)Bac-inrep感染Sf9細(xì)胞表達(dá)的Rep蛋白，同時(shí)用未感染的Sf9細(xì)胞和野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞作對(duì)照。相比對(duì)照，Bac-inrep P3感染的Sf9細(xì)胞可以表達(dá)AAV復(fù)制所必需的蛋白R(shí)ep 78、Rep 52以及Rep 40 (圖4)。

圖3 PCR鑒定重組Bacimd

2.3 制備AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體

兩種重組桿狀病毒Bac-inrep P3 (MOI=2) 和Bac-ITR-EGFP P3 (MOI=2) 同時(shí)感染Sf9 細(xì)胞，72 h后抽提小分子量DNA得到基因表達(dá)微載體。2×107的Sf9細(xì)胞抽提可以得到100 μg AAV-ITR基因表達(dá)微載體DNA。瓊脂糖凝膠電泳顯示，主要條帶在2.7 kb和5.4 kb，分別對(duì)應(yīng)基因表達(dá)微載體的單體和二聚體。推算得到其余的條帶上顯示的大小即為三聚體以及多聚體 (圖5A)。用Ⅰ單酶切做進(jìn)一步鑒定，得到 2 048 bp，670 bp的條帶 (圖5B)，與預(yù)期相符。

2.4 AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體在293T細(xì)胞中的表達(dá)

為了鑒定AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體在細(xì)胞中的基因表達(dá)能力，將AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體DNA用PEI轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。24 h、48 h后在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況。如圖6A所示，24 h后即有熒光表達(dá)，48 h (圖6B) 達(dá)到65%的陽(yáng)性率。該結(jié)果表明AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞并得到有效表達(dá)。

圖4 Western blotting檢測(cè)Rep蛋白

圖5 AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體鑒定

圖6 AAV-ITR-EGFP基因表達(dá)微載體轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞

3 討論

rAAV病毒載體對(duì)人體無(wú)明顯致病性，能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞以及為分裂細(xì)胞，能夠定點(diǎn)整合到人的19號(hào)染色體上，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，能夠在動(dòng)物模型體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。同時(shí)，該載體也存在安全性、免疫原性以及生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。在中制備得到的pDNA通常都會(huì)含有很多原核生物擴(kuò)增的必需序列，會(huì)引起DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生修飾比如N6-甲基腺嘌呤和N5-甲基胞嘧啶[4]，甚至?xí)疝D(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性[2]?；虮磉_(dá)微載體是指，不含有或很少含有細(xì)菌復(fù)制子序列、抗生素抗性基因序列等pDNA序列，僅保留基因表達(dá)所需要的順式元件，如基因表達(dá)啟動(dòng)子、目的基因和加尾序列 (poly A)，其外源基因能有效表達(dá)的環(huán)狀的DNA分子[16-17]。因此，我們制備得到的基因表達(dá)微載體免疫原性低，制備簡(jiǎn)單快速，避免了病毒載體和非病毒載體的缺陷。

Urabe等[18]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)得到3種桿狀病毒：重組桿狀病毒Bac-Rep、重組桿狀病毒Bac-VP和含有被AAV-ITR閱讀框架包裹的目的基因的重組桿狀病毒，共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，制備rAAV載體。其中，重組桿狀病毒Bac-Rep中表達(dá)的Rep 78和Rep 52為AAV復(fù)制關(guān)鍵蛋白，用于DNA的自我修復(fù)、復(fù)制和包裝[19]。但是，由于和r2序列重復(fù)可導(dǎo)致rep表達(dá)不穩(wěn)定，表達(dá)量降低，從而影響大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)量[20-21]。我們總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，在兩個(gè)啟動(dòng)子之間插入人工內(nèi)含子，保證Rep蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，有利于微載體的合成。Western blotting 鑒定Rep蛋白結(jié)果中除了目的蛋白R(shí)ep 78和Rep 52外還有很多小蛋白，其中Rep 40為Rep 52的剪切體，推測(cè)其他蛋白是Rep蛋白剪切過(guò)程中的中間體。

AAV-ITR基因表達(dá)微載體僅保留了制備微載體所必需的ITR順式作用元件，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中制備得到的基因表達(dá)微載體主要由單體和二聚體形式存在，無(wú)pDNA中CpG序列、抗菌素的抗性基因序列，因此可以減少基因治療過(guò)程中所引起的機(jī)體免疫反應(yīng)、細(xì)胞毒性等不良副作用以及抗生素基因產(chǎn)生的抗藥性，且由于分子量小，可以提高轉(zhuǎn)染效率[22]。

AAV-ITR基因表達(dá)微載體相對(duì)于AAV病毒載體具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先，不含有AAV病毒包膜蛋白Cap，安全性高，免疫原性低；其次，AAV基因載體最大插入基因僅4.5 kb，AAV-ITR基因表達(dá)微載體插入外源基因大小不受AAV包裝容量的限制；此外利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備基因表達(dá)微載體具有產(chǎn)量高、易于純化的優(yōu)點(diǎn)。

制備得到的AAV-ITR基因表達(dá)微載體能夠成功轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。后續(xù)將進(jìn)一步探討AAV-ITR基因表達(dá)微載體在體內(nèi)表達(dá)的效果以及在其他細(xì)胞中的毒性驗(yàn)證。

綜上所述，制備得到的AAV-ITR基因表達(dá)微載體有望成為一種更有前景的基因治療 載體。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Preparation of a novel AAV-ITR gene expression mini vector in Sf9 insect cells via baculovirus

Taiming Li1, Junjie Pan1, Jing Qi2, and Chun Zhang2

1,,210009,,2,,215163,,

AAV-ITR gene expression mini vector is a double-strand or single-strand DNA that only contains inverted terminal repeats of adeno-associated virus, cis-elements and gene of interest and does not contain any other foreign DNA sequences. We prepared Bac-ITR-EGFP and Bac-inrep. Spodoptera frugiperda cells were infected with Bac-ITR-EGFP (P3) and Bac-inrep (P3). Up to 100 μg of AAV-ITR-EGFP gene expression mini vectors were extracted from 2×107cells of Sf9 72 h after infection. The gel electrophoresis analysis shows that most forms of AAV-ITR-EGFP gene expression mini vector were monomer and dimer. The mini vector expression efficacy was examinedwith HEK 293T cells. The EGFP expression was observed at 24 h after transfection, and the positive ratio reached 65% at 48 h after transfection.

gene therapy, gene expression mini vector, Bac-to-Bac baculovirus expression system, non-viral vector

10.13345/j.cjb.140485

September 16, 2014; Accepted:December 1, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 81371670), Graduate Training Innovation Project of Jiangsu Province (No. SJLX_0285).

Chun Zhang. Tel: +86-512-69588327, E-mail: chunzhangspring@gmail.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81371670)，江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程 (No. SJLX_0285) 資助。

2015-01-14

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150114.1355.001.html