鄧思穎，張君麗，蔡真，李寅

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枯草芽胞桿菌L-天冬氨酸a脫羧酶的酶學性質

鄧思穎1,2，張君麗3，蔡真1，李寅1

1 中國科學院微生物研究所，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049 3 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

鄧思穎, 張君麗, 蔡真, 等. 枯草芽胞桿菌L-天冬氨酸a脫羧酶的酶學性質. 生物工程學報, 2015, 31(8): 1184–1193.Deng SY, Zhang JL, Cai Z, et al. Characterization of L-aspartate-a-decarboxylase from Bacillus subtilis. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1184–1193.

b-丙氨酸是一種重要的醫(yī)藥化工原料，目前主要依靠化學法進行生產。探尋更為環(huán)保和高效的生物生產法是未來研究的一個方向。L-天冬氨酸a脫羧酶 (PanD) 能特異地脫去L-天冬氨酸的a羧基，生成b-丙氨酸。本文比較了3種分別來源于大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌及枯草芽胞桿菌的PanD比酶活 (分別為0.98、7.52和8.4 U/mg)。后兩者的最適pH均為6.5，最適反應溫度分別為65 ℃及60 ℃。與目前研究最多的來源于大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的PanD相比，來源于枯草芽胞桿菌的PanD具有更好的活性和熱穩(wěn)定性，具有更強的工業(yè)應用潛力。同時，本文對該酶特有的翻譯后自剪切及機理性失活現象進行了分析和討論。

L-天冬氨酸a-脫羧酶，b-丙氨酸，枯草芽胞桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，酶學性質

b-丙氨酸是自然界中唯一存在的b型氨基酸，是一種非蛋白氨基酸。目前b-丙氨酸主要用于合成泛酸鈣、肌肽、帕米磷酸鈉、b-丙氨酸金屬配合物和巴柳氮等醫(yī)藥化工領域重要產品[1]。國內外多以化學法合成b-丙氨酸。化學合成法或是需要高溫高壓，或是產生大量的鹽，或是副反應多，對動力和三廢處理的要求較高[1]。因此探索更為環(huán)保的生物法生產b-丙氨酸是未來的一個研究方向。

研究發(fā)現L-天冬氨酸a脫羧酶 (L-aspartate-a-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)能特異性識別L-天冬氨酸，催化其脫掉a羧基生成b-丙氨酸。目前b-丙氨酸和L-天冬氨酸的售價有4?5倍的差值，這使得由L-天冬氨酸生物法生產b-丙氨酸極具工業(yè)化潛能。因此生物生產法的研究重點是如何尋找到一個高效的PanD。

研究發(fā)現PanD僅存在于微生物和植物中，是泛酸合成途徑中的關鍵酶[2]。PanD是1個非常特殊的四聚體蛋白[3]。它轉錄翻譯后得到1個無活性的前體蛋白 (p-蛋白，約14 kDa)。p-蛋白在第24位甘氨酸(Gly24) 和第25位絲氨酸(Ser25)之間發(fā)生分子內重排，從而導致肽鏈斷裂，自剪切形成1個C端含有羥基的b-亞基 (約3 kDa) 和1個N端含有丙酮?；腶-亞基 (約11 kDa)。這2個亞基的空間位置非常緊密，但卻沒有共價鍵鏈接[2]。而PanD的四聚體蛋白則是由3個剪切的p-蛋白和1個未剪切的p-蛋白組合而成，其中未剪切的p-蛋白在Gly24-Ser25處已發(fā)生重排形成酯鍵[4]。

目前報道的PanD主要來源于大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌及部分病原菌 (幽門螺旋桿菌、肺結核桿菌)。對PanD(PanD) 的研究主要集中于結構解析和自剪切機理[3-7]。對病原菌PanD的研究則主要希望找到其剪切和催化的關鍵位點作為抗菌藥物的新靶點[8-9]。這些研究均很少關注PanD的酶學性質。目前只有來源于和的PanD有酶活數據[10-12]。而對于選取生物催化劑時至關重要的幾個考慮因素 (如比酶活、最適反應條件、熱穩(wěn)定性等) 卻鮮有報道。這為選擇一個高效的PanD來催化L-天冬氨酸生產b-丙氨酸帶來困難。

本研究通過前期篩選發(fā)現，來源于枯草芽胞桿菌的PanD(PanD)具有較高的比酶活。隨后詳細測定了它的最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性及轉化L-天冬氨酸生產b-丙氨酸的能力等，并與目前研究較多的來源于和的PanD進行比較。研究結果表明PanD具有更高的活性和更好的熱穩(wěn)定性，因而具有更好的工業(yè)應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

subsp.str. 168、ATCC 13032及BL21(DE3)均來自實驗室菌種保藏。質粒pET-30a(+)購自Novagen公司。

1.1.2 主要酶、引物及試劑

DNA聚合酶、各限制性內切酶及T4DNA連接酶均購自NEB公司；基因組DNA提取試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR產物純化試劑盒均購自Omega公司；His Trap純化柱購自Novagen公司。本研究所用引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用到的引物

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及表達質粒構建方法

分別以subsp.str. 168、ATCC 13032及BL21(DE3)的基因組為模板，以PanD-For和PanD-Rev、PanD-For和PanD-Rev以及PanD-For和PanD-Rev為引物對在100mL體系中擴增片段，從而得到N端帶有His標簽的DNA片段panD、panD及panD。利用Ⅰ及Ⅰ雙酶切后連接到經同樣酶切的質粒載體pET-30a(+)上，獲得重組質粒pET-30a-panD、pET-30a-panD及pET-30a-panD。同時利用引物對PanZ-For和PanZ-Rev從基因組克隆得到基因，利用A Ⅰ連接于panD之后得到重組質粒pET-30a-panD-panZ。

1.2.2 重組蛋白誘導表達、純化及SDS-PAGE檢測方法

將重組質粒pET-30a-panD、pET-30a-panD、pET-30a-panD及pET-30a-panD-panZ分別轉化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21(DE3)/panD、BL21(DE3)/panD、BL21(DE3)/panD及BL21(DE3)/panD/。從平板上分別挑取各個重組菌的單菌落，接種于5 mL含50mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將1 mL上述過夜培養(yǎng)物接種于100 mL含50mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液600=0.4后加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L。30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后收集100 mL菌體。將收集菌體用10 mL的超聲緩沖液 (HEPPS 0.1 mol/L，pH 8.0；EDTA 1 mmol/L；MgCl220 mmol/L) 復懸后進行超聲破碎。超聲破碎上清經His Trap柱純化 (方法參照Novagen His Bind Kits) 后用SDS-PAGE檢測純度。

1.2.3b-丙氨酸及L-天冬氨酸濃度的HPLC檢測方法

流動相：0.035 mol/L乙酸鈉，30% (/)甲醇水溶液。衍生劑：鄰苯二甲醛0.1 mol/L，N-乙酰-L-半胱氨酸0.036 mol/L，20% (/)乙醇水溶液。衍生反應：取300mL待測樣品加入360mL硼酸鈉緩沖液 (0.05 mol/L，pH 9.5)，再加入240mL衍生劑，充分混勻后靜置 2 min，之后進樣10mL檢測。色譜柱為Aglent ZRABOX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長334 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min。

1.2.4 重組酶最適溫度的測定

酶活定義：每分鐘轉化底物L-天冬氨酸生成1mmol產物b-丙氨酸所需的酶量為1個酶活力單位 (1 U)。

將25mg重組酶加入1 mL含50 mmol/L L-天冬氨酸的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分別于37、45、55、60、65、70、75及80 ℃下反應20 min，加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 終止反應，利用HPLC測定b-丙氨酸產量并計算酶活。

1.2.5 重組酶熱穩(wěn)定性的測定

將25mg重組酶加入0.933 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分別于37、50、60及65 ℃下溫育12 h。然后加入67mL L-天冬氨酸溶液 (750 mmol/L，NaOH溶解，pH 7.0)，在相同溫度下反應20 min。加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 終止反應。利用HPLC測定b-丙氨酸產量并計算酶活。

1.2.6 重組酶反應過程中穩(wěn)定性的測定

將25mg重組酶加入1 mL含50 mmol/L L-天冬氨酸的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分別于37、50及60 ℃下反應20 min、40 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h及4 h，加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 終止反應，利用HPLC測定b-丙氨酸產量隨時間變化的曲線。將曲線進行多項式擬合，以2值大于99%為宜。對該多項式求導，計算各個時刻的瞬時酶活。

1.2.7 重組酶最適pH的測定

將25mg重組酶分別加入0.933 mL的pH 5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.6、8.0及9.0的緩沖液中靜置5 min，后加入67mL L-天冬氨酸溶液 (750 mmol/L，NaOH溶解，pH 7.0)。37 ℃下反應20 min，后加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 終止反應。利用HPLC測定b-丙氨酸產量并計算酶活。

pH 5.0、5.6、6.0緩沖液用0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制。pH 6.5、7.0緩沖液用0.1 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配制。pH 7.6、8.0、9.0緩沖液用0.02 mol/L巴比妥鈉-鹽酸緩沖液配制。

1.2.8 重組酶的轉化實驗

將7.5 mg重組酶投入300 mL的L-天冬氨酸溶液 (50 mmol/L，NaOH溶解，pH 6.5) 中。37 ℃水浴，350 r/min攪拌，并鼓泡通氣，用 1 mol/L H2SO4控制反應體系pH為(6.5±0.3)。

2 結果與分析

2.1 重組酶的構建及純化

通過PCR從、及基因組中克隆得到長度分別為384、411及381 bp的基因片段panDpanD及panD，并通過引物在其N端加入含有6個組氨酸的His6標簽。將上述基因片段置于pET-30a(+)上T7啟動子下游，得到3個重組質粒pET-30a-panD、pET-30a-panD、pET-30a-panD?？紤]到PanD必須在另一蛋白PanZ的輔助下才能在常溫下發(fā)生自剪切[5]，因此我們從基因組中克隆得到384 bp的片段，將其連同T7啟動子一起插入pET-30a-panD中，得到重組質粒pET-30a-panD-panZ。

將上述4個重組質粒轉化BL21(DE3)，在0.2 mmol/L IPTG作用下30 ℃誘導12 h后破碎細胞。利用鎳柱對超聲破碎液進行親和純化，純化后的重組酶SDS-PAGE驗證結果如圖1所示，純度均在90%以上。

如圖1所示，在沒有基因的情況下，表達PanD后得到的是完全沒有剪切的無活性的p-蛋白。而在共表達基因后，PanD幾乎完全剪切，形成a亞基 (約12?13 kDa) 及b亞基 (約2.8 kDa)。有趣的是，PanD和PanD不需要任何輔助因子即可完成自剪切。這表明不同來源的PanD有著不同的剪切機理。

圖1 PanD的純化

2.2 重組酶的比酶活

在常規(guī)反應條件 (37 ℃，pH 7.0) 下，3種重組酶的比酶活分別為0.98、7.52和8.4 U/mg。由于PanD比酶活太低，且在表達過程中需要添加PanZ輔助剪切，較難實現工業(yè)應用，因此后續(xù)實驗主要以PanD及PanD為研究對象。

2.3 重組酶的最適反應條件

PanD和PanD在不同溫度下的酶活如圖3A所示。兩者的酶活隨溫度升高均呈現先急劇上升后快速下降的趨勢，其最適溫度分別為65 ℃和60 ℃。兩者在最適反應溫度下的酶活為15.2 U/mg和17.2 U/mg，分別為37 ℃酶活的2.4倍和2.3倍。表明該酶的活性對溫度變化非常敏感。另外，各個溫度下PanD的酶活均比PanD高出13%左右。

圖2 PanD的比酶活

37 ℃下PanD和PanD的酶活隨pH同樣呈現先上升后下降的趨勢，但在pH 5.0到9.0之間，兩者的酶活變化幅度僅為45%左右。這說明該酶具有較寬范圍的pH適應性。2個酶的最適pH均為6.5 (圖3B)。酸性條件下PanD的優(yōu)勢不明顯，而在中性及堿性條件下，PanD的酶活普遍比PanD高出10%?20%。

2.4 重組酶的穩(wěn)定性

PanD和PanD在不同溫度下溫浴12 h后的殘余活性如圖4 A所示。37 ℃溫浴12 h后，PanD和PanD的酶活損失僅為1%和8%。說明兩者在該溫度下具有較好的穩(wěn)定性。隨著溫浴溫度升高，兩者的酶活損失也增多。65 ℃條件下兩者的酶活損失分別增至27%和57%。對比2組數據可以看出，各個溫度下PanD的酶活損失均高于PanD，且溫度越高這種差距越明顯，表明PanD具有更強的熱穩(wěn)定性。

PanD和PanD在不同溫度下反應的穩(wěn)定性如圖4B所示。各個溫度下，兩者的酶活隨反應時間線性失活，且溫度越高，失活速率越快。37 ℃反應1 h，兩者酶活損失約為14%?18%。50 ℃反應1 h，兩者酶活損失約為46%?52%。而60 ℃反應1 h酶活損失約為90%?96%。與圖4A中溫浴的酶活損失相比，這2個酶在反應時酶活損失非常劇烈。比如，60 ℃溫浴12 h，PanD和PanD的酶活損失為27%及57%，而同樣溫度下反應1 h，兩者的酶活損失即高達96%和90%。這是因為PanD屬于丙酮?；蕾囆兔擊让?，在催化過程中會出現因電子錯誤重排導致活性中心改變而發(fā)生機理性失活[13-15]。這種機理性失活和催化過程相伴相生，且催化越多，失活越快。這也可以解釋由于PanD的酶活略高于PanD，因而在反應過程中會表現出比PanD略快的失活。

2.5 重組酶的轉化實驗

雖然提高反應溫度有助于提高PanD和PanD的酶活，但在高溫條件下反應時，酶活損失非常快，因此我們仍然選取常規(guī)的37 ℃進行轉化實驗。轉化過程中每隔1 h測定反應體系中b-丙氨酸的濃度，結果如圖5所示。無論是哪個酶，b-丙氨酸產量均未隨反應時間線性增長，這是由于2.4小節(jié)中提到的機理性失活所致。轉化8 h后，PanD得到2.23 g/Lb-丙氨酸，比PanD提高18%，具有更大的工業(yè)應用潛力。

圖5 PanD的轉化實驗

3 討論

在石油資源枯竭以及生存環(huán)境惡化的大背景下，化學品的生物生產法因其能耗低、污染小而備受矚目。而生物催化走向工業(yè)化生產的最大障礙是能否找到一個足夠高效和廉價的生物催化劑。因此酶的搜尋和改進一直是生物催化的核心。本課題組在前期篩選過程中發(fā)現來源于的PanD具有更高的比酶活。本文的詳細表征也表明該酶具有更好的熱穩(wěn)定性，并能在實際轉化過程中得到更多的產物，為生物催化L-天冬氨酸生產b-丙氨酸提供了一個更好的催化劑選擇。

本研究中3種不同來源的PanD的氨基酸序列相似性不高，如圖6所示，僅為53.0%。其中a亞基的相似性為72.2%，而b亞基相似性僅為48.7%。其中，PanD和PanD兩者的氨基酸序列相似性為48.91%，略高于它們各自與PanD的相似性 (44.88%和39.71%)，這或許可以解釋前兩者與后者的酶學性質差別較大的原因。NCBI上公布的PanD序列超過5 000種，有大量潛在基因值得分析比較。通過基因篩選有望獲得更高酶活和穩(wěn)定性的PanD。

圖6 PanD序列比對

PanD作為丙酮?；蕾囆偷拿擊让?，需要在翻譯后通過電子重排促使肽鏈斷裂，形成丙酮?；鵞2]。早期研究普遍認為PanD的剪切是完全自發(fā)進行的。直到2012年才發(fā)現來源于和沙門氏菌的PanD必須在另一蛋白 (PanZ或PanM) 的作用下才能在常溫下進行剪切形成丙酮酰基[5,16]。而本研究也證實，PanD在沒有PanZ時幾乎完全不剪切，而過表達PanZ后幾乎完全剪切。表明PanZ確實能促進PanD剪切。但是PanD和PanD卻完全不需要任何促進因子。究竟是什么造成了這種剪切的差異還有待進一步研究。Nozaki等[5]曾對32種不同來源的PanD進行了氨基酸序列比對，并在其基因組中搜索PanZ同源序列。結果表明，PanZ只存在于以為代表的腸道內生菌中，這可能是由于腸道內生菌生活在泛酸相對豐富的環(huán)境中，細菌通過PanZ調節(jié)PanD自剪切能有效控制b-丙氨酸的生成，從而調控泛酸的代謝[5,16]。已有研究表明PanZ/PanM受到乙酰-CoA的調控，對于微生物體內泛酸的合成途徑具有一定的調節(jié)作用[5,16-17]。

PanD的另一個顯著特點是存在機理性失活。1987年Anton等[14-15]發(fā)現S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶 (丙酮酰基依賴型脫羧酶) 在轉化過程中發(fā)生快速失活。隨后機理研究表明失活的原因是酶-底物復合物脫羧后的電子錯誤重排。丙酮?；鳛榛钚灾行模瑫c底物結合形成1個含有席夫堿的酶-底物復合物。該復合物發(fā)生脫羧后形成1個烯醇化物類似物。若該烯醇化物類似物發(fā)生正確的電子重排，則會形成新的希夫堿，水解生成產物并還原酶分子上的丙酮酰基。若電子重排錯誤則不能形成希夫堿，后續(xù)水解釋放醛化底物并在酶分子上生成丙氨酸殘基，即活性中心發(fā)生轉氨基作用而失活[9,18-19]。

雖然對于S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的機理性失活研究較為透徹，但關于PanD的機理性失活現象直到2009年才有報道。研究者發(fā)現來源于PanD在轉化過程中會發(fā)生不可逆失活，且這種失活不能通過固定化手段來減少[20]。我們研究表明PanD和PanD在多個反應溫度下均存在機理性失活，而且反應溫度越高，酶活越高，失活也越快。因而推測PanD可能具有和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶同樣的失活機理。由于機理性失活中酶的失活和產物生成是兩條相伴相生的并行路徑，形成了“不催化則不失活，催化越多失活越快”的矛盾。傳統(tǒng)的優(yōu)化反應條件、固定化酶等手段均無法改善。因此，我們認為，只有對酶分子本身進行改造，特別是對酶分子中那些與催化密切相關的氨基酸進行改造，才有可能改變現有的酶-底物復合物發(fā)生正確重排和錯誤重排的比例，減少機理性失活。而且理論上，如果改變后的酶分子結構有利于酶-底物復合物的正確電子重排，則其催化效率也有可能增加，從而實現穩(wěn)定性和催化活性的同步提高。這部分工作我們也正在進行中。

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(本文責編 陳宏宇)

Characterization of L-aspartate-a-decarboxylase from

Siying Deng1,2, Junli Zhang3, Zhen Cai1, and Yin Li1

1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

As an important material in pharmaceutical and chemical industry,b-alanine was mainly produced by chemical methods. L-aspartate-a-decarboxylase could catalyze thea-decarboxylation from L-aspartate tob-alanine. Determinations for specific activities of PanDs from,andwere performed in this study (0.98 U/mg, 7.52 U/mg and 8.4 U/mg respectively). The optimal temperature and pH of PanDs from.and.were 65 °C, pH 6.5 and 60 °C, pH 6.5 respectively. According to our research, PanD from.could be more appropriate for industrial application because of the higher activity and thermostability when compared to PanDs from.and.which had been the most studied. We also analyzed and discussed the special post-translation self-cleavage phenomenon and the mechanism based inactivation.

L-aspartate-a-decarboxylase,b-alanine,,, enzyme characterization

10.13345/j.cjb.140109

February 20, 2014; Accepted: March 27, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 21106175).

Yin Li. Tel/Fax: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

國家自然科學基金(No. 21106175) 資助。