郝小明，陳博，安泰

?

工業(yè)微生物酸脅迫的耐受機(jī)制及改造途徑

郝小明1,2，陳博1,2，安泰1,2

1 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209 2 國家能源生物液體燃料研發(fā) (實(shí)驗(yàn)) 中心，北京 100020

郝小明, 陳博, 安泰. 工業(yè)微生物酸脅迫的耐受機(jī)制及改造途徑. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1151–1161.Hao XM, Chen B, An T. Pathway modification of industrial microorganisms to improve acid-stress tolerance. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1151–1161.

工業(yè)微生物在發(fā)酵生產(chǎn)過程中會(huì)面對(duì)發(fā)酵環(huán)境和自身產(chǎn)生的各類酸性物質(zhì)，而這些酸性物質(zhì)會(huì)影響工業(yè)微生物的生長和代謝，即產(chǎn)生酸脅迫。微生物通過調(diào)控胞內(nèi)質(zhì)子濃度、保護(hù)和修復(fù)生物大分子、改變細(xì)胞膜組分以及整體水平調(diào)控等耐受機(jī)制來應(yīng)對(duì)酸脅迫。結(jié)合酸脅迫的各種耐受機(jī)制，利用自然篩選和人工改造的方法提高工業(yè)微生物的抗酸脅迫能力，為構(gòu)建出更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件的菌株提供理論依據(jù)。

工業(yè)微生物，酸脅迫，耐受機(jī)制，改造途徑，菌株改造

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用可再生的生物質(zhì)資源進(jìn)行生物燃料以及各種化學(xué)和材料產(chǎn)品的生產(chǎn)已經(jīng)成為生物產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)2013年全年的產(chǎn)品總產(chǎn)量2 424萬t，2013年總產(chǎn)值接近3 000億元。其中，氨基酸產(chǎn)量400萬t，有機(jī)酸產(chǎn)量158萬t，淀粉糖產(chǎn)量1 225萬t，多元醇產(chǎn)量157萬t，酶制劑產(chǎn)量110萬t，酵母產(chǎn)量29.4萬t，功能發(fā)酵產(chǎn)品 310萬t[1]。當(dāng)今中國以氨基酸、有機(jī)酸為代表的大宗發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)能位列世界前茅，同時(shí)，生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)面臨著產(chǎn)能過剩、能耗高、產(chǎn)出低等一些亟待解決的問題。

在工業(yè)發(fā)酵條件下，微生物面臨著諸多生理或非生理逆境脅迫，如高溫脅迫[2-4]、酸環(huán)境脅迫[5-7]、抑制物脅迫[8]、高滲脅迫[8]和氧化脅迫[9]等。為了維持適應(yīng)微生物發(fā)酵的生產(chǎn)環(huán)境，常通過添加中和劑、冷卻等手段進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生高滲環(huán)境或增加能耗。例如，有機(jī)酸、氨基酸在生產(chǎn)過程中會(huì)引起不利于細(xì)胞生長與維持正常代謝活性的酸性環(huán)境，為了維持生產(chǎn)條件的穩(wěn)定性，通常需要應(yīng)用外源中和劑實(shí)施pH干預(yù)，工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)通過補(bǔ)加氨水、液氨等堿性物質(zhì)將pH控制在適合的范圍。發(fā)酵結(jié)束后，為了便于提取氨基酸、有機(jī)酸產(chǎn)品，又會(huì)加入濃硫酸等使發(fā)酵液pH降低至pH 3.5甚至更低。若將氨基酸或有機(jī)酸生產(chǎn)菌株的耐酸脅迫能力提高，使得發(fā)酵過程在酸性環(huán)境下進(jìn)行，則能顯著降低發(fā)酵過程和產(chǎn)品分離過程中酸和堿的使用，同時(shí)由于生產(chǎn)菌株酸耐受性的增加，最終產(chǎn)量還有可能得到進(jìn)一步提高。以丁二酸發(fā)酵為例，若將pH由中性7.0降低為5.5左右，則可節(jié)約1/3堿使用量，在分離過程中進(jìn)一步節(jié)約1/3酸使用量[10]。此外，維持發(fā)酵pH在較低的值還有助于抑制雜菌污染。因此，通過提高工業(yè)微生物自身的環(huán)境脅迫耐受性，可保證在脅迫條件下良好的細(xì)胞活性，可在提高生產(chǎn)效率的同時(shí)降低能耗，減少污染物的排放，實(shí)現(xiàn)建設(shè)資源節(jié)約型和環(huán)境友好型的產(chǎn)業(yè)目標(biāo)。

各類酸性物質(zhì)會(huì)影響工業(yè)微生物的生長和代謝，引起細(xì)胞膜解偶聯(lián)，抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性水平，并且會(huì)影響核糖體RNA和DNA的功能[5]。因此利用微生物對(duì)酸脅迫產(chǎn)生的各種耐受機(jī)制來提高微生物的酸耐受水平則顯得尤為重要。本文在綜述工業(yè)微生物酸脅迫的各種耐受機(jī)制的基礎(chǔ)上，從自然篩選和人工改造的角度出發(fā)，闡述提高微生物菌株抗酸脅迫的一些改造方法，探討工業(yè)微生物抗逆改造的發(fā)展方向。

1 酸脅迫的種類和影響

各種類型的酸類物質(zhì)通過被動(dòng)運(yùn)輸或主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞皆诩?xì)胞內(nèi)外進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)酸積累量超過一定限度時(shí)，即會(huì)產(chǎn)生酸脅迫。酸脅迫通過影響胞內(nèi)外質(zhì)子和陰離子的濃度對(duì)細(xì)胞膜、核糖體RNA和DNA、活性酶類產(chǎn)生破壞作用，從而影響微生物正常的生長和代謝過程。

1.1 酸脅迫的種類及轉(zhuǎn)運(yùn)方式

1.1.1 酸脅迫的種類

工業(yè)微生物在有氧和厭氧發(fā)酵生產(chǎn)過程中會(huì)面對(duì)各種類型的酸類物質(zhì)，包括發(fā)酵環(huán)境和自身產(chǎn)生的一些酸類物質(zhì)，有乙酸、甲酸、乳酸、酪酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、氨基酸 (例如天冬氨酸和谷氨酸)、丙酸，還包括外部添加的一些酸類物質(zhì)，如作為防腐劑的苯甲酸、山梨酸等。

1.1.2 酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式

酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)一般有兩種方式：非能量依賴的被動(dòng)運(yùn)輸和能量依賴的主動(dòng)運(yùn)輸[11]。在被動(dòng)運(yùn)輸過程中，主要通過自由擴(kuò)散或者在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助下運(yùn)輸未解離的酸類物質(zhì)。在主動(dòng)運(yùn)輸過程中，細(xì)胞會(huì)利用分子泵和通透酶對(duì)酸類物質(zhì)進(jìn)行運(yùn)輸。分子泵一般用于酸根離子在應(yīng)激反應(yīng)條件下進(jìn)行外排，而通透酶用于將酸類物質(zhì)在代謝過程中轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)。

1.2 酸脅迫對(duì)微生物細(xì)胞的影響

1.2.1 酸脅迫產(chǎn)生的原因

在生物發(fā)酵過程中，酸性物質(zhì)的過量積累會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)質(zhì)子和陰離子的積累，從而產(chǎn)生毒性作用[12]。酸性物質(zhì)以未解離的分子形式通過擴(kuò)散作用進(jìn)入胞內(nèi)，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)迅速發(fā)生解離，釋放出質(zhì)子。在細(xì)胞膜表面的腺苷三磷酸酶ATPase幫助下，消耗ATP的同時(shí)利用質(zhì)子泵將質(zhì)子泵出胞外，同時(shí)通過主動(dòng)運(yùn)輸將酸根離子泵出胞外。隨著酸性物質(zhì)的逐漸積累達(dá)到高濃度時(shí)，質(zhì)子泵達(dá)到最大限度，導(dǎo)致胞內(nèi)質(zhì)子積累。同時(shí)，ATP被消耗殆盡，擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的酸根離子因無法主動(dòng)運(yùn)輸至胞外，導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)的積累。

1.2.2 酸脅迫的危害

酸脅迫在細(xì)胞層面通過以下3個(gè)方面對(duì)微生物產(chǎn)生影響。首先，由于跨膜ΔpH的減少導(dǎo)致跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)ΔP的降低，從而使細(xì)胞膜發(fā)生解偶聯(lián)[13]；其次，胞內(nèi)過多質(zhì)子的積累所引起的脫嘌呤作用會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，從低pH條件下培養(yǎng)的大腸桿菌提取的基因組中發(fā)現(xiàn)有更多鏈的斷裂[14]；此外，由于胞內(nèi)pH的降低，細(xì)胞內(nèi)在正常pH條件下才具有活性的酶會(huì)受到嚴(yán)重的影響。因此，酸脅迫會(huì)導(dǎo)致微生物生長和代謝受到抑制。

2 酸脅迫的耐受機(jī)制

不同的微生物在長期的進(jìn)化過程中形成了自身面對(duì)酸脅迫的各種耐受機(jī)制，主要包括利用F1F0-ATP酶和分子外排泵將質(zhì)子或酸類物質(zhì)排出細(xì)胞外、通過消耗質(zhì)子和生成氨類物質(zhì)來減少胞內(nèi)質(zhì)子、修復(fù)和防止酸類物質(zhì)對(duì)生物大分子的傷害、改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)質(zhì)子的通透性以及在整體水平上的系統(tǒng)調(diào)控等方法。對(duì)主要工業(yè)微生物耐酸機(jī)制的舉例如表1[5-7]所示。

面對(duì)不同的酸類物質(zhì)，微生物也會(huì)采用不同的耐受機(jī)制。當(dāng)面對(duì)強(qiáng)酸時(shí)，微生物會(huì)通過內(nèi)部的緩沖作用和離子流快速調(diào)整胞內(nèi)pH，一些在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在強(qiáng)酸環(huán)境下無法作出快速響應(yīng)。而微生物面對(duì)弱酸時(shí)，由于弱酸的解離速度低于強(qiáng)酸，其耐受機(jī)制更為復(fù)雜。不同的弱酸的特定理化性質(zhì)及周圍環(huán)境的pH會(huì)對(duì)不同的微生物產(chǎn)生復(fù)雜的效果[6]。例如對(duì)于氨基酸產(chǎn)生的酸脅迫，大腸桿菌一般通過脫羧或脫氨基的方法降低胞內(nèi)質(zhì)子濃度[17-20]。在乳酸菌中利用乳酸-蘋果酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將乳酸從胞內(nèi)泵出胞外[34]。而對(duì)酵母乙酸耐受的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其在乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等方面均有相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制[35]。

總體而言，微生物通常會(huì)通過以下幾種方式對(duì)酸脅迫產(chǎn)生一定的耐受效果。

表1 主要工業(yè)微生物的耐酸機(jī)制[5-7]

2.1 F1F0-ATP酶和分子外排泵

催化ATP生成和水解的酶是一種多蛋白復(fù)合體，稱為ATP合成酶。ATP合成酶包含2個(gè)不同的部分：球狀的F1頭部和包埋在內(nèi)膜中的F0基部。F1F0-ATP酶能通過水解ATP提供的能量將細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子泵出胞外，以維持pH平衡。研究發(fā)現(xiàn)，在pH 2.5的酸性環(huán)境中，敲除F1F0-ATP基因會(huì)降低大腸桿菌的生存水平[16]。

微生物通過分子外排泵可以將胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)排至胞外空間并保護(hù)細(xì)胞免受這些化學(xué)物質(zhì)的影響。各種類型的分子外排泵需要來自ATP提供的能量和離子產(chǎn)生的電化學(xué)梯度作為外排動(dòng)力。分子外排泵一般由膜外排蛋白、膜融合蛋白 (Membrane fusion protein，MFP) 和外膜通道蛋白(Outer membrane protein，OMP) 三部分組成[36]。分子外排泵在維持微生物胞內(nèi)pH的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。例如，大腸桿菌中的四碳二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DctA和Dcu可以協(xié)助對(duì)琥珀酸和檸檬酸進(jìn)行攝入和外排作用[37-38]。在釀酒酵母中，羧酸分子外排泵Pdr12p對(duì)一元羧酸具有耐受作用。此外，Pdr12p還對(duì)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸這些代謝得到的酸類物質(zhì)具有耐受作用[39]。

2.2 脫羧反應(yīng)和脫氨基反應(yīng)

氨基酸脫羧酶在消耗質(zhì)子的同時(shí)，使谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)。每一種氨基酸脫羧酶會(huì)與識(shí)別它的反向轉(zhuǎn)運(yùn)體相結(jié)合，在外界pH降低到閾值以下被激活，不同的氨基酸底物在不同的pH條件下會(huì)產(chǎn)生不同的脫羧后產(chǎn)物[40]。

微生物通過脫氨基產(chǎn)生的氨與質(zhì)子結(jié)合形成銨離子來提高胞內(nèi)的pH水平。精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)一般由精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶 (OTC)、氨甲酰磷酸激酶 (CK) 所組成，這些酶均在pH 3.1或更低的pH條件下具有活性。該系統(tǒng)能催化精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸、二氧化碳和氨，并且產(chǎn)生的ATP還可以用于F1F0-ATP酶對(duì)胞漿質(zhì)子的外排。此外，谷氨酰胺酶和腺苷脫氨酶也在大腸桿菌的酸脅迫過程中利用類似的機(jī)制發(fā)揮耐酸作用[19-20]。

2.3 保護(hù)和修復(fù)大分子

蛋白質(zhì)大分子暴露在酸性環(huán)境下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)的積累，微生物會(huì)利用熱休克蛋白進(jìn)行應(yīng)對(duì)。熱休克蛋白是幫助蛋白正確折疊和修復(fù)損傷蛋白的分子伴侶。在革蘭氏陰性菌大腸桿菌中，熱休克蛋白可以分為DnaK (Hsp70)、DnaJ (Hsp40)、GrpE、GroEL (Hsp60)、GroES (Hsp10)和Clp (Hsp100)[41]。而在革蘭氏陽性菌枯草芽胞桿菌中，熱休克蛋白主要包括和操縱子編碼的基因、σB因子調(diào)控的基因[42]等。

在正常條件下，熱休克蛋白可以對(duì)蛋白進(jìn)行折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、組裝和分解寡聚蛋白或者幫助降解不穩(wěn)定的蛋白防止蛋白聚集。然而在壓力刺激下，熱休克蛋白也可防止蛋白聚集并協(xié)助修復(fù)受損蛋白[43]。面對(duì)酸性刺激，微生物會(huì)通過胞漿中DnaK和GroEL進(jìn)行應(yīng) 對(duì)[44-45]。此外，一些微生物會(huì)通過介導(dǎo)Clp蛋白酶復(fù)合物來去除受損的蛋白質(zhì)[46]。

2.4 改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組分

微生物通過改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成來調(diào)控細(xì)胞的通透性或流動(dòng)性從而抵抗酸脅迫。在釀酒酵母中，構(gòu)成細(xì)胞壁組分和影響其相關(guān)功能的基因如和，如果敲除會(huì)分別影響酵母菌株對(duì)乙酸和乳酸的耐受能力，說明細(xì)胞對(duì)不同有機(jī)酸的響應(yīng)存在一定差異。細(xì)胞壁的合成能阻止一些酸性物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，推測(cè)在酸脅迫條件下細(xì)胞壁出現(xiàn)重構(gòu)，與細(xì)胞壁合成的相關(guān)基因及結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)發(fā)生改變[35]。大腸桿菌通過降低不飽和脂肪酸的濃度并提高環(huán)丙烷脂肪酸的濃度來改變細(xì)胞膜的組分。此外，結(jié)合在外膜孔道蛋白的多磷酸鹽或五甲烯二胺也可以降低質(zhì)子流的形成[40]。而乳酸菌一般會(huì)通過增加膜脂的不飽和度和碳鏈長度來應(yīng)對(duì)酸脅迫[7]。

2.5 整體水平調(diào)控

目前，通過“組學(xué)”技術(shù) (基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)) 對(duì)酸脅迫的響應(yīng)機(jī)制的研究越來越多，其在表型表征中發(fā)揮的作用也越來越重要[47]。通過整體水平調(diào)控的研究，可以全面了解菌株整體上協(xié)同的耐酸機(jī)制，同時(shí)也可以深入了解酸脅迫對(duì)于菌株轉(zhuǎn)錄與調(diào)控的影響及對(duì)應(yīng)表型發(fā)生的變化。

在大腸桿菌對(duì)乙酸和丙酸耐受反應(yīng)的基因芯片分析中發(fā)現(xiàn)，一些介導(dǎo)趨化現(xiàn)象和鞭毛運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因表達(dá)水平上調(diào)，而對(duì)碳源攝取和利用的相關(guān)基因表達(dá)水平下降，說明正常代謝受到酸脅迫影響，此外一些應(yīng)對(duì)壓力反應(yīng)的相關(guān)基因表達(dá)水平也有所提高。對(duì)丙酸的耐受反應(yīng)中還發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中的相關(guān)基因表達(dá)水平也有所上調(diào)[48]。在另外一個(gè)對(duì)于大腸桿菌酸耐受的研究中還發(fā)現(xiàn)，氨基酸脫羧、甘油轉(zhuǎn)運(yùn)子、滲透壓反應(yīng)、鐵調(diào)控子、氧化脅迫反應(yīng)、琥珀酸脫氫酶等相關(guān)基因表達(dá)水平均有所提高[49]。

對(duì)于谷氨酸棒桿菌耐受乳酸的基因芯片和基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在酸脅迫過程中σB因子和σE因子的重要作用：σB因子基因敲除后降低了菌株的酸耐受性，而σE因子基因敲除后可以提高酸耐受性。此外，通過基因芯片數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳代謝和呼吸代謝通路以及DNA損傷修復(fù)的重要基因的表達(dá)水平均有所上調(diào)[31]。

3 微生物酸脅迫的改造途徑

3.1 自然菌株的篩選

目前，工業(yè)用發(fā)酵菌株僅占自然界中菌株的一小部分。因此，從自然界中篩選到可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株仍然是一種潛在的途徑與手段。在酸脅迫方面，一種途徑是尋找可以利用于工業(yè)生產(chǎn)的嗜酸性菌株[50]。另一種途徑是從“污染的”菌株中尋找具有較強(qiáng)抗酸性能的菌株。在特定發(fā)酵環(huán)境周圍的“雜菌”具有更強(qiáng)的環(huán)境脅迫抵抗能力。例如，在巴西的一項(xiàng)長達(dá)12年對(duì)350種不同釀酒酵母菌株篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些來自發(fā)酵環(huán)境的菌株具有更好的生長優(yōu)勢(shì)和耐受效果，在以甘蔗為原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的工廠中分離的一株釀酒酵母PE-2與一株商業(yè)化酵母菌株CEN.PK113-7D相比，可以在含有 105 mmol/L 乙酸的pH小于3的培養(yǎng)條件下具有更好的酸耐受效果[51-52]。

3.2 菌株的改造途徑

3.2.1 傳統(tǒng)菌株改造途徑

傳統(tǒng)的菌株改造途徑包括誘變育種、馴化、雜交、原生質(zhì)體融合等[53]。這些傳統(tǒng)育種手段共同的特點(diǎn)是通過基因組的隨機(jī)突變或隨機(jī)重組，以酸脅迫作為篩選手段，最終獲得酸耐受性提高的菌株。運(yùn)用傳統(tǒng)菌株改造方法，雖然改造過程的隨機(jī)性較大，篩選過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但是菌株一般是通過提升了酸脅迫的某種耐受機(jī)制而達(dá)到抗酸水平提高的效果。例如Almario等利用馴化逐步提高乙酸、糠醛等抑制劑的濃度，使菌株在乙酸中的存活率提高12%[54]，通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁、脂類代謝和ATP酶相關(guān)基因表達(dá)水平均有所提高，說明參與ATP合成的相關(guān)酶類以及構(gòu)建細(xì)胞壁、細(xì)胞膜組成的蛋白在馴化的過程中發(fā)生了改變。

3.2.2 基因工程和代謝工程改造

近年來，隨著對(duì)各類微生物耐酸脅迫機(jī)制研究的深入，通過基因工程、代謝工程等技術(shù)手段改造工業(yè)微生物得到了快速的發(fā)展，結(jié)合微生物的酸脅迫的耐受機(jī)制，通過過表達(dá)或敲除與酸耐受機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵基因，使菌株的耐酸水平得到一定水平的提高。如表2所示，例如Abdullah等利用熱休克蛋白對(duì)蛋白保護(hù)和修復(fù)的機(jī)制，在乳酸菌NZ9000中異源表達(dá)大腸桿菌的dnaK蛋白，提高了其對(duì)乳酸的耐受水 平[56]。又如，Zhang等利用細(xì)胞膜組分改變對(duì)酸脅迫的影響，通過插入基因破壞水-甘油跨膜通道蛋白編碼的基因，使改造菌株與對(duì)照菌株相比，在乙酸耐受水平和乙醇產(chǎn)量上均有所提高[57]。Wei等通過在釀酒酵母SR8菌株中引入乙酸降解通路和木糖還原酶-木酮糖脫氫酶通路，使釀酒酵母可以同時(shí)利用木糖和乙酸代謝產(chǎn)生乙醇，從代謝通路和整體水平調(diào)控的角度降低乙酸對(duì)釀酒酵母的毒性[59]。

表2 利用工業(yè)微生物耐酸機(jī)制進(jìn)行的人工改造

3.2.3 系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)改造

利用簡單的基因工程和代謝工程操作對(duì)于多基因決定的性狀難以實(shí)現(xiàn)理想的效果，此外僅過表達(dá)或敲除某幾個(gè)基因可能引起代謝網(wǎng)絡(luò)的紊亂[60]。因此，利用系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的方法，從整體水平對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)的定量和定性分析，以序列模塊化和元件化進(jìn)行組裝的設(shè)計(jì)思路，并且結(jié)合耐酸脅迫的幾種耐受機(jī)制入手，從整體水平對(duì)工業(yè)微生物進(jìn)行系統(tǒng)而程序化的改造將是未來發(fā)展的方向與重點(diǎn)。

目前國內(nèi)外有多個(gè)研究小組已著手將來源于不同微生物的、能夠響應(yīng)酸脅迫的調(diào)控元件和能夠提高抗酸性能的功能元件加以整理歸納，通過人工設(shè)計(jì)構(gòu)建成抗酸器件，利用系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)方法在模式底盤微生物和工業(yè)底盤微生物中進(jìn)行抗酸性能、底盤適應(yīng)性等評(píng)估，最終形成標(biāo)準(zhǔn)化的抗酸元器件庫，從而為研究菌株的抗酸性能及改造途徑提供重要指導(dǎo)[10]。

4 展望

經(jīng)濟(jì)與社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展對(duì)于生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)提出了越來越高的環(huán)保與能耗要求，提高包括耐酸性能在內(nèi)的工業(yè)菌株逆境耐受能力，對(duì)于發(fā)酵行業(yè)的節(jié)能減排降耗、生產(chǎn)水平提升與工藝革新具有重大意義。

一方面，傳統(tǒng)的菌株改造技術(shù)將繼續(xù)為工業(yè)界提供相對(duì)簡單易行的工業(yè)菌株抗逆性能改造手段。另一方面，更精細(xì)化的各種改造方法的不斷發(fā)展與普遍運(yùn)用，使得對(duì)于各種類型菌株的抗逆機(jī)制的研究與改造越來越深入，而基于抗逆機(jī)制的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、基于宏基因組技術(shù)的功能基因獲取、基于自動(dòng)化平臺(tái)的高通量篩選和快速發(fā)展的合成生物學(xué)技術(shù)為自然抗逆元器件的大規(guī)模挖掘與評(píng)估、人工抗逆元器件的設(shè)計(jì)、組裝與優(yōu)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，必將促使工業(yè)菌株得到更高效的抗逆改造。

在我國，有關(guān)工業(yè)微生物菌株酸脅迫改造正在進(jìn)行，并隨著精細(xì)化改造的應(yīng)用而快速發(fā)展。運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)手段對(duì)菌株酸脅迫抗性進(jìn)行改造，還需重點(diǎn)研究抗逆元器件與底盤微生物的適配性，抗逆元器件對(duì)于逆境脅迫問題的精確與可控響應(yīng)，以及抗逆性能與生產(chǎn)性能的協(xié)調(diào)與平衡等課題，這些研究對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)抗逆元器件在工業(yè)菌株中的應(yīng)用具有重要意義。

可以預(yù)期，隨著研究的深入，將會(huì)更有效地探明菌株酸脅迫關(guān)鍵基因信息及酸脅迫過程菌株調(diào)控的整體動(dòng)態(tài)變化，為構(gòu)建出更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件的菌株提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

[1] 石維忱. 生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)2013年產(chǎn)值接近3000億元[EB/OL]. [2014-04-28]. http://unn.people.com. cn/n/2014/0428/c82452-24951188.html.

[2] Abdel-Banat BM, Hoshida H, Ano A, et al. High-temperature fermentation: how can processes for ethanol production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast? Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(4): 861–867.

[3] Taylor MP, Eley KL, Martin S, et al. Thermophilic ethanologenesis: future prospects for second–generation bioethanol production. Trends Biotechnol, 2009, 27(7): 398–405.

[4] Cheng C, Kao KC. How to survive being hot and inebriated. Science, 2014, 346(6205): 35–36.

[5] Nicolaou SA, Gaida SM, Papoutsakis ET. A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing: From biofuels and chemicals, to biocatalysis and bioremediation. Metab Eng, 2010, 12(4): 307–331.

[6] Lund P, Tramonti A, de Biase D. Coping with low pH: molecular strategies in neutralophilic bacteria. FEMS Microbiol Rev, 2014, 1091–1125.

[7] Wu C, Huang J, Zhou R. Progress in engineering acid stress resistance of lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(3): 1055–1063.

[8] Do?an A, Demirci S, Aytekin A?, et al. Improvements of tolerance to stress conditions by genetic engineering induring ethanol production. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 174(1): 28–42.

[9] de la Torre-Ruiz MA, Mozo-Villarías A, Pujol N, et al. How budding yeast sense and transduce the oxidative stress signal and the impact in cell growth and morphogenesis. Curr Protein Pept Sci, 2010, 11(8): 669–679.

[10] 林章凜. 抗逆元器件的構(gòu)建和機(jī)理研究[EB/OL]. [2013-12-31]. http://www.nstrs.cn/xiangxiBG. aspx?id=51681.

[11] Casal M, Paiva S, Queirós O, et al. Transport of carboxylic acids in yeasts. FEMS Microbiol Rev, 2008, 32(6): 974–994.

[12] Russell JB, Diez-Gonzalez F. The effects of fermentation acids on bacterial growth. Adv Microb Physiol, 1998, 39: 205–234.

[13] Russell JB. The energy spilling reactions of bacteria and other organisms. J Mol Microbiol Biotechnol, 2007, 13(1/3): 1–11.

[14] Jeong KC, Hung KF, Baumler DJ, et al. Acid stress damage of DNA is prevented by Dps binding inO157: H7. BMC Microbiol, 2008, 8: 181.

[15] Foster JW.acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(11): 898–907.

[16] Sun Y, Fukamachi T, Saito H, et al. Respiration and the F?Fo-ATPase enhance survival under acidic conditions in. PLoS ONE, 2012, 7(12): e52577.

[17] Castanie-Cornet MP, Penfound TA, Smith D, et al. Control of acid resistance in. J Bacteriol, 1999, 181(11): 3525–3535.

[18] Iyer R, Williams C, Miller C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in. J Bacteriol, 2003, 185(22): 6556–6561.

[19] Sun Y, Fukamachi T, Saito H, et al. Adenosine deamination increases the survival under acidic conditions in. J Appl Microbiol, 2012, 112(4): 775–781.

[20] Lu P, Ma D, Chen Y, et al. L-glutamine provides acid resistance forthrough enzymatic release of ammonia. Cell Res, 2013, 23(5): 635–644.

[21] Hong W, Wu YE, Fu X, et al. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol, 2012, 20(7): 328–335.

[22] Mujacic M, Baneyx F. Chaperone Hsp31 contributes to acid resistance in stationary-phase. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(3): 1014–1018.

[23] Chang YY, Cronan JE Jr. Membrane cyclopropane fatty acid content is a major factor in acid resistance of. Mol Microbiol, 1999, 33(2): 249–259.

[24] O'Sullivan E, Condon S. Relationship between acid tolerance, cytoplasmic pH, and ATP and H+-ATPase levels in chemostat cultures of. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(6): 2287–2293.

[25] Budin-Verneuil A, Maguin E, Auffray Y, et al. Genetic structure and transcriptional analysis of the arginine deiminase (ADI) cluster inMG1363. Can J Microbiol, 2006, 52(7): 617–622.

[26] Frees D, Vogensen FK, Ingmer H. Identification of proteins induced at low pH in. Int J Food Microbiol, 2003, 87(3): 293–300.

[27] Budin-Verneuil A, Maguin E, Auffray Y, et al. Transcriptional analysis of the cyclopropane fatty acid synthase gene ofMG1363 at low pH. FEMS Microbiol Lett, 2005, 250(2): 189–194.

[28] Koponen J, Laakso K, Koskenniemi K, et al. Effect of acid stress on protein expression and phosphorylation inGG. J Proteomics, 2012, 75(4): 1357–1374.

[29] Su MS, Schlicht S, G?nzle MG. Contribution of glutamate decarboxylase into acid resistance and persistence in sourdough fermentation. Microb Cell Fact, 2011, 10 (Suppl 1): S8.

[30] Broadbent JR, Larsen RL, Deibel V, et al. Physiological and transcriptional response ofATCC 334 to acid stress. J Bacteriol, 2010, 192(9): 2445–2458.

[31] Jakob K, Satorhelyi P, Lange C, et al. Gene expression analysis ofsubjected to long-term lactic acid adaptation. J Bacteriol, 2007, 189(15): 5582–5590.

[32] Ding J, Huang X, Zhang L, et al. Tolerance and stress response to ethanol in the yeast. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 85(2): 253–263.

[33] Zhao XQ, Bai FW. Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production. J Biotechnol, 2009, 144(1): 23–30.

[34] Poolman B, Molenaar D, Smid EJ, et al. Malolactic fermentation: electrogenic malate uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy. J Bacteriol, 1991, 173(19): 6030–6037.

[35] Zhao XQ, Zhang MM, Xu GH, et al. Advances in functional genomics studies underlying acetic acid tolerance of. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 368–380 (in Chinese).趙心清, 張明明, 徐桂紅, 等. 釀酒酵母乙酸耐性分子機(jī)制的功能基因組進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 368–380.

[36] Ramos JL, Duque E, Gallegos MT, et al. Mechanisms of solvent tolerance in gram-negative bacteria. Annu Rev Microbiol, 2002, 56: 743–768.

[37] Janausch IG, Zientz E, Tran QH, et al. C4-dicarboxylate carriers and sensors in bacteria. Biochim Biophys Acta, 2002, 1553(1/2): 39–56.

[38] Scheu PD, Kim OB, Griesinger C, et al. Sensing by the membrane-bound sensor kinase DcuS: exogenous versus endogenous sensing of C(4)-dicarboxylates in bacteria. Future Microbiol, 2010, 5(9): 1383–1402.

[39] Hazelwood LA, Tai SL, Boer VM, et al. A new physiological role for Pdr12p in: export of aromatic and branched-chain organic acids produced in amino acid catabolism. FEMS Yeast Res, 2006, 6(6): 937–945.

[40] Kanjee U, Houry WA. Mechanisms of acid resistance in. Annu Rev Microbiol, 2013, 67: 65–81.

[41] Lund PA. Multiple chaperonins in bacteria--why so many? FEMS Microbiol Rev, 2009, 33(4): 785–800.

[42] Helmann JD, Wu MF, Kobel PA, et al. Global transcriptional response ofto heat shock. J Bacteriol, 2001 , 183(24): 7318–7328.

[43] Tomas CA, Welker NE, Papoutsakis ET. Overexpression of groESL inresults in increased solvent production and tolerance, prolonged metabolism, and changes in the cell's transcriptional program. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4951–4965.

[44] Bearson SM, Bearson BL, Rasmussen MA. Identification ofserovar Typhimurium genes important for survival in the swine gastric environment, Appl Environ Microbiol, 2006, 72(4): 2829–2836.

[45] Zanotti G, Cendron L. Functional and structural aspects ofacidic stress response factors. IUBMB Life, 2010, 62(10): 715–723.

[46] Mols M, van Kranenburg R, van Melis CC, et al. Analysis of acid-stressedreveals a major oxidative response and inactivation-associated radical formation. Environ Microbiol, 2010, 12(4): 873–885.

[47] Fu RY, Li Y. Improving industrial microbial stress resistance by metabolic engineering: a review. Chin J Biotech, 2010, 26(9): 1209–1217 (in Chinese).付瑞燕, 李寅. 利用代謝工程技術(shù)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫的抗性. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(9): 1209–1217.

[48] Polen T, Rittmann D, Wendisch VF, et al. DNA microarray analyses of the long-term adaptive response ofto acetate and propionate. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(3): 1759–1774.

[49] Kannan G, Wilks JC, Fitzgerald DM, et al. Rapid acid treatment of: transcriptomic response and recovery. BMC Microbiol, 2008, 8: 37.

[50] Sengun IY, Karabiyikli S. Importance of acetic acid bacteria in food industry. Food Control, 2011, 22: 647–656.

[51] Basso LC, de Amorim HV, de Oliveira AJ, et al. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res, 2008, 8(7): 1155–1163.

[52] Della-Bianca BE, de Hulster E, Pronk JT, et al. Physiology of the fuel ethanol strainPE-2 at low pH indicates a context-dependent performance relevant for industrial applications. FEMS Yeast Res, 2014, 14(8): 1196–1205.

[53] Steensels J, Snoek T, Meersman E, et al. Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity. FEMS Microbiol Rev, 2014, 38(5): 947–995.

[54] Almario MP, Reyes LH, Kao KC. Evolutionary engineering offor enhanced tolerance to hydrolysates of lignocellulosic biomass. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(10): 2616–2623.

[55] Zhang X, Liu S, Takano T. Overexpression of a mitochondrial ATP synthase small subunit gene (AtMtATP6) confers tolerance to several abiotic stresses inand. Biotechnol Lett, 2008, 30(7): 1289–1294.

[56] Abdullah-Al-Mahin, Sugimoto S, Higashi C, et al. Improvement of multiple-stress tolerance and lactic acid production inNZ9000 under conditions of thermal stress by heterologous expression ofDnaK. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(13): 4277–4285.

[57] Zhang JG, Liu XY, He XP, et al. Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance ofby disruption of the FPS1 aquaglyceroporin gene. Biotechnol Lett, 2011, 33(2): 277–284.

[58] Zhang J, Fu RY, Hugenholtz J, et al. Glutathione protectsagainst acid stress. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 5268–5275.

[59] Wei N, Quarterman J, Kim SR, et al. Enhanced biofuel production through coupled acetic acid and xylose consumption by engineered yeast. Nat Commun, 2013, 4: 2580.

[60] Zhao XQ, Bai FW, Li Y. Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for biofuel production. Chin J Biotech, 2010, 26(7): 880–887 (in Chinese).趙心清, 白鳳武, 李寅. 系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)研究在生物燃料生產(chǎn)菌株改造中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(7): 880–887.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Pathway modification of industrial microorganisms to improve acid-stress tolerance

Xiaoming Hao1,2, Bo Chen1,2, and Tai An1,2

1 Nutrition & Health Research Institute, COFCO Corporation, Beijing 102209, China 2 National Energy Research Center of Liquid Biofuels, Beijing 100020, China

Different types of acids from fermentation environment or industrial microorganisms exist during fermentation process. Acids may inhibit growth and metabolism of industrial strains, namely acid stress. The tolerance mechanisms of acid stress include regulation of intracellular proton concentration, protection and restoration of intracellular macromolecules, changes in cell membrane composition and acid stress response at whole cell level. Screening and modification methods have been applied to improve acid-stress tolerance of industrial strains for decades. In this review, we provide insights into acid-stress tolerance of industrial microorganisms and address the modification of microbial pathways to improve acid-stress tolerance.

industrial strain, acid stress, tolerance mechanism, modification method, strains modification

10.13345/j.cjb.140496

October 21, 2014; Accepted: March 23, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733900), Beijing Nova Program (No. Z141105001814031), COFCO Technological Development Project (No. 2013-C2-T010).

Tai An. Tel: +86-10-56989581; Fax: +86-10-56989555; E-mail: antai@cofco.com

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB733900)，北京市科技新星計(jì)劃 (No. Z141105001814031)，中糧集團(tuán)技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目 (No. 2013-C2-T010) 資助。