周偉忠，傅紅興，吳嵐嵐，劉成洋，廖麗，黃斌炯

（1.義烏市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，浙江 金華 322000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

·技術(shù)與方法·

一種小型復(fù)方雷帕霉素栓劑的制備及其體外質(zhì)量評(píng)價(jià)

周偉忠1，傅紅興2，吳嵐嵐1，劉成洋2，廖麗2，黃斌炯2

（1.義烏市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，浙江 金華 322000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：制備一種適用于大型動(dòng)物腹部器官移植術(shù)后的免疫抑制藥物栓劑，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法：以雷帕霉素（rapamycin）和他克莫司（tacrolmius）為原料藥，聚乙二醇2000和聚乙二醇4000為主要基質(zhì)，采用熱熔法結(jié)合定量注模成型工藝制備復(fù)方栓劑，并對(duì)其外觀、重量差異、融變時(shí)限、藥物含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：復(fù)方雷帕霉素栓劑外觀呈白色半透明狀，室溫下硬度較好，長(zhǎng)度短，重量差異、融變時(shí)限和藥物含量均符合栓劑要求。結(jié)論：本方法制備的復(fù)方雷帕霉素栓劑質(zhì)量符合栓劑要求，為該藥物的新藥開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

復(fù)方；雷帕霉素；他克莫司；栓劑；質(zhì)量評(píng)價(jià)

大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部器官移植術(shù)后往往進(jìn)食困難，但及時(shí)應(yīng)用免疫抑制劑又是術(shù)后抗排異治療的重要內(nèi)容[1]。栓劑可經(jīng)直腸給藥，避免口服和胃腸道藥物吸收的首過(guò)效應(yīng)，達(dá)到全身療效，可作為替代胃腸道給藥的一種良好的選擇[2]。

免疫抑制藥物的聯(lián)合應(yīng)用可起到減量、增效和降低不良反應(yīng)[3]的效果，如臨床上經(jīng)常同時(shí)應(yīng)用雷帕霉素（rapamycin）和他克莫司（tacrolmius）作為免疫抑制劑[4-6]。本研究以雷帕霉素和他克莫司為模型藥物，采用熱熔法結(jié)合定量注模成型工藝制備了含該兩種藥物的小型復(fù)方雷帕霉素栓劑，并對(duì)其體外質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為該藥物應(yīng)用于犬或獼猴等動(dòng)物腹部器官移植打下了基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 試劑 雷帕霉素原料藥（純度98.0%，批號(hào)：P130825，廣州億邦醫(yī)藥科技有限公司），標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%，批號(hào)：20130605，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；他克莫司原料藥（純度98.0%，批號(hào)：1309892，湖北盛天恒創(chuàng)生物科技有限公司），標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%，批號(hào)：20130726，上海惠誠(chéng)生物科技有限公司）；聚乙二醇2000、聚乙二醇4000，甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 SJM-10子彈型栓劑模型（長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）；大功率恒溫磁力攪拌器（90-1B，上海司樂(lè)儀器有限公司）；融變時(shí)限儀（WZ-50CZ，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；色譜柱：Agilent Eclips XDB-C18 4.6 mm×250 mm，Agilent高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器（Agilent1100，美國(guó)）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方雷帕霉素栓劑的制備

2.1.1 處方：根據(jù)前期摸索[7]，得到栓劑配方如下：聚乙二醇2000 0.208 g，聚乙二醇4000 5.06 g，甘油0.8 g，蒸餾水0.528 mL，雷帕霉素50 mg，他克莫司50 mg，制備栓劑10粒。

2.1.2 制備工藝：采用熱熔法[3]結(jié)合定量注塑成型工藝制備栓劑，具體如下：取30 mL燒杯，加入磁力攪拌子，依次稱(chēng)取聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、甘油和蒸餾水至燒杯中，放至帶加熱功能的磁力攪拌器上，70 ℃水浴融化；稱(chēng)取雷帕霉素和他克莫司至已融化的含基質(zhì)燒杯中，繼續(xù)水浴70 ℃攪拌15～20 min，使兩種藥物混懸均勻；用1 mL一次性注射針筒依次吸取已經(jīng)混懸好的含藥混懸栓劑的基質(zhì)0.66 mL，快速推注至含脫模劑（乙醇）的栓劑模型中，等其冷卻，或置于-4 ℃冰箱中3～5 min，等其充分凝固后，脫模即得。

2.2 栓劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 栓劑的外觀檢查：栓劑應(yīng)要求外形光滑完整，不得軟化、變形或干裂；顏色均勻一致，藥物和基質(zhì)混合完全；塞入腔道后應(yīng)無(wú)刺激性，并能融化、軟化[8]。

2.2.2 重量差異檢查：根據(jù)《中國(guó)藥典》[8]規(guī)定：取栓劑10粒，精密稱(chēng)定質(zhì)量，求得平均粒重后，再分別精密稱(chēng)定各粒的質(zhì)量。每粒的質(zhì)量與平均粒重相比較，超出質(zhì)量差異限度的粒數(shù)不得多于1粒，并不得超出限度的一倍。

2.2.3 融變時(shí)限：取栓劑3粒，按《中國(guó)藥典》2010年版[8]融變時(shí)限檢查裝置和檢查方法檢查，水溶性基質(zhì)的栓劑應(yīng)在60 min內(nèi)全部溶解。如有一粒不合格應(yīng)另取3粒復(fù)試，應(yīng)符合規(guī)定。

2.2.4 藥物含量測(cè)定：

2.2.4.1 色譜方法的建立：參考文獻(xiàn)[9-10]并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期摸索，色譜條件如下：色譜柱：Agilent Eclips XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-3.3%磷酸溶液（65∶35）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：50 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μ L；走樣時(shí)間：20 min。

2.2.4.2 樣品溶液的配制：配制空白栓劑樣品溶液，稱(chēng)取不含藥物的空白栓劑樣品0.1450 g（相當(dāng)于1/5含藥栓的重量），以乙腈為溶劑溶解并定容至10 mL即得；配制兩種藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稱(chēng)取雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品和他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，混合后以乙腈為溶劑溶解并定容至10 mL即得；配制供試品溶液，稱(chēng)取含藥栓劑樣品0.1462 g（相當(dāng)于1/5含藥栓的重量），以乙腈為溶劑溶解并定容至10 mL即得。分別以此三種溶液進(jìn)樣，觀察藥物的出峰情況，記錄出峰時(shí)間、分離度、理論塔板數(shù)等參數(shù)。

2.2.4.3 線性關(guān)系考察：精密稱(chēng)取雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品和他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別置于25 mL干燥棕色容量瓶中，加適量乙腈振蕩溶解，用乙腈定容至終濃度為400.0 μ g/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。用移液管分別精密量取該儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL至10 mL干燥棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至濃度為8.0、20.0、40.0、80.0、200.0 μ g/mL的工作液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，母液進(jìn)樣方法同上。以濃度（C，μ g/mL）為縱坐標(biāo)，峰面積（A）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.2.4.4 藥物的含量測(cè)定：取3批復(fù)方雷帕霉素栓劑樣品，切碎后精密稱(chēng)取栓劑粉末（含雷帕霉素和他克莫司各約0.5 mg），置于50 mL干燥容量瓶中，加入乙腈振搖使其溶解并定容，吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液各20 μ L進(jìn)樣，測(cè)定雷帕霉素和他克莫司的峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方法分析處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 外觀色澤 復(fù)方雷帕霉素栓劑外觀呈白色半透明狀，表面光滑完整，在室溫25 ℃下成型性較好，有一定的硬度，無(wú)軟化、變形或干裂，如圖1所示。本方法制備的栓劑長(zhǎng)度為（16.0±0.7）mm，遠(yuǎn)短于該模具常規(guī)方法制備的栓劑長(zhǎng)度（29.3±0.6）mm。

圖1 復(fù)方雷帕霉素栓劑外觀圖

圖2 各藥物的高效液相色譜圖

3.2 重量差異 本實(shí)驗(yàn)制備的栓劑重量為（0.67± 0.01）g，差異非常小，而且符合栓劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)重量差異的要求（＜±10%），遠(yuǎn)低于該模具常規(guī)方法制備的普通聚乙二醇栓劑的重量[為（1.75±0.05）g]。

3.3 融變時(shí)限結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)方雷帕霉素栓劑融變時(shí)限為（16.4±0.8）min，水性基質(zhì)栓劑融變時(shí)限＜60 min，因此本栓劑符合栓劑融變時(shí)限要求。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果

3.4.1 各藥物的出峰結(jié)果：抽取空白栓劑樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各20 μ L進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，他克莫司與雷帕霉素有較好的分離，兩種藥物的色譜峰保留時(shí)間分別為約15和18 min，分離度R為2.01，理論板數(shù)分別為2 358和3 618，空白栓劑成分在該處不出峰。

3.4.2 線性關(guān)系結(jié)果：雷帕霉素和他克莫司的峰面積和濃度的回歸方程分別為：C=0.0616A+0.5503，r=0.9999和C=0.0615A+0.3639，r=0.9999；結(jié)果表明兩藥物濃度在8.0～400.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4.3 藥物的含量測(cè)定：取3批復(fù)方雷帕霉素栓劑樣品配成雷帕霉素和他克莫司溶液后，HPLC進(jìn)樣20 μL，對(duì)各藥物的峰面積按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

為解決大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部器官移植（如獼猴的腎移植、胰島細(xì)胞移植）術(shù)后，口服免疫抑制劑困難的問(wèn)題，并結(jié)合動(dòng)物直腸較短和免疫抑制劑需劑量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了該小型復(fù)方雷帕霉素栓劑，可提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥順應(yīng)性，彌補(bǔ)常規(guī)口服免疫抑制劑的不足和常規(guī)栓劑長(zhǎng)度較長(zhǎng)（對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）及切后使用不便的缺陷。如果動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，該藥可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成臨床應(yīng)用的復(fù)方免疫抑制劑，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究為相關(guān)小型栓劑的開(kāi)發(fā)提供了參考，也為該新型免疫抑制藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1] Niemann CU,Eilers H.Abdominal organ transplantation[J].Minerva Anestesiol,2010,76(4):266-275.

[2] 崔福德.藥劑學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:298-305.

[3] Wei X,Jiang H,Li Q.Organ transplantation in China—not yet a new era[J].Lancet,2014,384(9945):741.

[4] 陳國(guó)勇,孫建軍,謝寒冰,等.他克莫司和雷帕霉素對(duì)肝癌移植患者Foxp3+Treg產(chǎn)生的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2011,9(36):26-27.

[5] Flechner SM,Gurkan A,Hartmann A,et al.A randomized,open-label study of sirolimus versus cyclosporine in primary de novo renal allograft recipients[J].Transplantation,2013,95(10):1233-1241.

[6] Soleimani AR,Kamkar I,Nikoueinejad H,et al.Comparison of cyclosporine and sirolimus effects on serum creatinine level over five years after kidney transplantation[J].Transplant Proc,2013,45(4):1644-1647.

[7] 朱雁林,傅紅興,周偉忠,等.雷帕霉素栓劑的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,44(2):148-150.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:附錄ID.

[9] 陳悅.HPLC法測(cè)定他克莫司的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志,2008,28(2):309-313.

[10] 魏靜,徐國(guó)旭,龔鎧,等.雷帕霉素眼膏的制備及其含量測(cè)定[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2010,12(6):11-14.

（本文編輯：吳昔昔）

Preparation and in vitro quality evaluation of a small type of compound rapamycin suppositories

ZHOUWeizhong1,FU Hongxing2,WU Lanlan1,LIU Chengyang2,LIAO Li2,HUANG Binjiong2.
1.Department of Pharmacy,Yiwu Chinese Medicine Hospital,Jinhua,322000; 2.School of Pharmacy,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035

Objective:To develop a small type of suppository of immunosuppressive agents to suit for large animals after abdominal organ transplantation,and carry out it’s quality evaluation.Methods:Rapamycin and tacrolimusas were chosed as active pharmaceutical ingredients,and polyethylene glycol 2000,polyethylene glycol 4000 were used as substrate.Melting followed with a quantitative injection molding process was used to prepare he small type of compound suppository.The appearance,weight difference,melting time and drug content of he suppository were evaluated.Results:The compound rapamycin suppository was translucent,white,and had good hardness at room temperature.It’s short,and the weight variation,melting time and drug content were conormed to the requirements of the suppository.Conclusion:The compound rapamycin suppository prepared by his method conforms to the quality of suppository,which makes a good foundation for the development of the new drug.

compound; rapamycin; tacrolimus; suppositories; quality evaluation

R944

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.011

2014-09-11

義烏市科研計(jì)劃項(xiàng)目（13-3-28）。

周偉忠（1964-），男，浙江紹興人，副主任藥師。