孫余省，朱冠保，金勁激，陶禮鈞，朱維星，方軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.創(chuàng)傷外科；2.胃腸外科）

·論 著·

查爾酮類似物A59促人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制

孫余省1，朱冠保2，金勁激2，陶禮鈞1，朱維星1，方軍1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.創(chuàng)傷外科；2.胃腸外科）

目的：通過對(duì)經(jīng)初步篩選證明具有生物活性的查爾酮類似物A59可能涉及的信號(hào)通道進(jìn)行檢測，進(jìn)一步明確其抗腫瘤活性及作用機(jī)制。方法：對(duì)于以查爾酮為先導(dǎo)物設(shè)計(jì)合成類似物，以MTT法檢測其對(duì)于人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）的殺傷作用，篩選出具有較好生物活性的化合物A59。通過FCM法檢測A59誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期的情況。Western blot法檢測HCT-116細(xì)胞中A59對(duì)ATF4及CHOP表達(dá)的影響。利用siRNA技術(shù)敲除CHOP后，用免疫熒光和FCM法檢測在A59對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：通過對(duì)自行設(shè)計(jì)合成查爾酮類似物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)A59對(duì)于HCT-116具有較強(qiáng)的增殖抑制作用（IC50=7.6 μmol/L）。通過FCM法檢測發(fā)現(xiàn)A59是通過誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞發(fā)生凋亡并抑制細(xì)胞周期發(fā)揮其生物活性。通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)A59劑量依賴性激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白CHOP，并通過siRNA基因沉默技術(shù)進(jìn)一步確證A59是通過刺激CHOP的過表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)論：查爾酮類似物A59通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道中的關(guān)鍵蛋白CHOP來發(fā)揮對(duì)CHT116的增殖抑制作用。

查爾酮類似物；腫瘤藥；細(xì)胞凋亡； CHOP

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢[1]。雖然手術(shù)切除在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用，但化療仍然是腫瘤治療的主要手段之一。目前部分化療藥物的不良反應(yīng)大且耐受性差局限了其在部分患者中的使用，而一些傳統(tǒng)天然藥物中的化合物體現(xiàn)出了不良反應(yīng)小，抗腫瘤能力強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。

查爾酮及其衍生物是芳香醛酮發(fā)生交叉羥醛縮合的產(chǎn)物，廣泛存在于天然藥物中，其分子結(jié)構(gòu)柔性大，能與不同的抗體結(jié)合，具有毒性低、較好的抗腫瘤、清除氧自由基、抗菌等生物活性[3-7]。但查爾酮雖然有抗癌活性，但活性并不理想。迄今為止雖有多種查爾酮類化合物運(yùn)用于臨床，如利膽藥甲氧查爾酮、治療靜脈曲張的橙皮苷甲基查爾酮等，但鮮有成藥用于腫瘤的相關(guān)治療[8]。為了發(fā)現(xiàn)抗腫瘤效果更佳的查爾酮類似物，本研究以查爾酮為母核設(shè)計(jì)合成化合物A59，通過MTT法檢測A59抗結(jié)腸癌的活性，為A59是否能成為治療結(jié)腸癌的新型藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 結(jié)腸癌細(xì)胞株（HCT-116）、HL7702人肝細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫，CLEAVED-PARP抗體、CHOP免疫熒光二抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔抗體購自美國santa cruz公司，Cleaved-caspase3、GAPDH、CHOP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Bcl-2、Bad、MDM2、CDC2、Cyclinb1、ATF4抗體購自美國SANTA公司，胎牛血清（無支原體）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，青-鏈霉素（100×）購自吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司，0.25%胰蛋白酶（含EDTA）購自美國HyClone公司，0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）購自美國Gibco公司，錐蟲藍(lán)購自上海生科生物有限公司，MTT試劑盒購自Roche公司。

1.2 HCT-116細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116用含有10%無支原體胎牛血清（經(jīng)56 ℃水浴鍋30 min滅活）和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，濕度飽和，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT比色實(shí)驗(yàn) 將狀態(tài)良好的HCT-26細(xì)胞鋪板，每孔加入不同濃度的H175（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L），并設(shè)置DMSO陰性對(duì)照和查爾酮陽性對(duì)照，所有標(biāo)本重復(fù)3孔檢測，輕輕混勻以確保每個(gè)藥都已加入液面以下，48 h后每孔加入10 μL MTT進(jìn)行反應(yīng)，4 h后每孔加入200 μL裂解液，使反應(yīng)產(chǎn)物完全溶解，16 h后置酶標(biāo)儀上測定每反應(yīng)孔的A值，波長為570 nm。MTT法檢測其對(duì)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，計(jì)算出IC50值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)期的HCT-116細(xì)胞調(diào)整至4×105/mL，進(jìn)行藥物處理，每個(gè)培養(yǎng)皿里加入3 μL的不同濃度A59（2.5、5、10 μmol/L），并設(shè)置DMSO陰性對(duì)照和查爾酮陽性對(duì)照，所有標(biāo)本重復(fù)3孔檢測，輕輕混勻。加藥12 h后收集細(xì)胞，用PBS洗2遍后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，1 mL PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，1 000 r/min離心5 min，棄上清用1×Binding Buffer重懸，避光后加1 μL Annexin V染色10 min后，加1 μL PI染色5 min，加400 μL×Binding Buffer進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測細(xì)胞周期 將處于對(duì)數(shù)期的HCT-116細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，每個(gè)培養(yǎng)皿里加入3 μL的不同濃度（2.5、5、10 μmol/L）A59，并設(shè)置DMSO陰性對(duì)照、查爾酮陽性對(duì)照，濃度為10 μmol/L。加藥12 h后收集細(xì)胞用PBS洗2遍，棄上清，1 mL PBS重懸細(xì)胞，用100 g/mL RNase-A和100 g/mL PI各500 μL，37 ℃避光孵育30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 細(xì)胞Western blot法檢測 收集對(duì)數(shù)期的HCT-116細(xì)胞，用不同濃度（2.5、5、10 μmol/L）A59、DMSO（陰性對(duì)照）及查爾酮（陽性對(duì)照）進(jìn)行處理，藥物孵育24 h后收集蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，用一抗為凋亡相關(guān)蛋白抗體（1∶300 CLEAVED-PARP抗體、1∶1 000 Cleaved-caspase3抗體、1∶300 Bcl-2、Bad抗體）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白抗體（1∶300 MDM2、CDC2、Cyclinb1抗體）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路關(guān)鍵蛋白抗體（1∶1 000 CHOP抗體、1∶300 AFT-4、1∶1 000 GAPDH抗體）分別于4 ℃過夜，TBST洗膜后加二抗為抗兔抗體，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后進(jìn)行曝光。

1.7 HCT-116細(xì)胞CHOP基因敲除 通過siRNA靶向設(shè)計(jì)，美國Ambion公司設(shè)計(jì)CHOP核苷酸序列5′-GCAG GAAATCGAGCGCCTGAC-3′。經(jīng)過PCR兩步法，人基因組DNA為模板，擴(kuò)增hU6snRNA啟動(dòng)子序列，外加終結(jié)子克隆到PGL3.7載體中，并用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）做標(biāo)記，經(jīng)過酶切和DNA測序證明其序列的正確性。通過Fugene 6轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到H460細(xì)胞中，48 h后，通過顯微鏡數(shù)具有熒光標(biāo)記的細(xì)胞。

1.8 CHOP基因敲除的HCT-116細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞凋亡檢測 將處于對(duì)數(shù)期的正常HCT-116細(xì)胞（NC組）和敲除CHOP基因的HCT-116細(xì)胞（CHOP siRNA，siRNA組）調(diào)整至4×105/mL，并在正常HCT-116細(xì)胞中加入3 μL查爾酮類似物A59（終濃度為20 μmol/ L）處理12 h（NC+A59組），siRNA+A59組處理辦法同NC+A59組。于各組中加入一抗為CHOP抗體，二抗為CHOP免疫熒光抗體進(jìn)行免疫熒光檢測；并使用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法對(duì)CHOP基因敲除HCT-116細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析各組間的血清抗體OD值的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 查爾酮類似物A59的合成及抑制HCT-116細(xì)胞增殖 查爾酮類似物A59結(jié)構(gòu)如圖1A。MTT結(jié)果（見圖1B-C）顯示：各濃度組的A59均能顯著抑制HCT-116細(xì)胞，且隨著藥物濃度增加，對(duì)HCT-116細(xì)胞抑制效果愈顯著，呈劑量依賴性，與陽性對(duì)照（查爾酮）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A59對(duì)抗結(jié)腸癌的IC50為7.6 μmol/L，查爾酮的IC50為13.9 μmol/L；并且A59和查爾酮對(duì)正常肝細(xì)胞的IC50均大于20 μmol/L，說明其毒性很小。

2.2 A59對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用不同濃度（5、10 μmol/L）的A59處理HCT-116細(xì)胞，均能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并具有劑量依賴性，與DMSO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（早期凋亡P=0.0040，晚期凋亡P=0.0028），且促凋亡能力強(qiáng)于陽性對(duì)照（查爾酮組）（見圖2A），其中以早期凋亡為主（見圖2B），具有時(shí)間依賴性。為了檢測經(jīng)不同濃度A59處理后的HCT-116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-parp、cleavedcaspase3、Bcl-2及Bad的表達(dá)水平，分別利用相應(yīng)抗體進(jìn)行Western blot法分析，結(jié)果（見圖2C）提示A59可以劑量依賴性地促進(jìn)活性PARP以及Caspase3、Bad的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。

圖1 查爾酮類似物A59的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對(duì)HCT-116增殖的抑制作用

圖2 不同濃度A59對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

2.3 A59對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（見圖3A）顯示：HCT-116細(xì)胞經(jīng)A59藥物（5、10 μmol/L）處理12 h后，HCT-116細(xì)胞增殖阻滯于G2/M期，且具有劑量依賴關(guān)系。應(yīng)用周期相關(guān)蛋白抗體進(jìn)行的Western blot法分析結(jié)果（見圖3B）提示，A59劑量依賴性地抑制細(xì)胞周期蛋白MDM2、CDC2及Cyclinb1。

圖3 不同濃度A59對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的影響

2.4 A59對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道中關(guān)鍵蛋白的影響 結(jié)果（見圖4A）顯示，A59可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道中關(guān)鍵蛋白ATF-4及CHOP表達(dá)轉(zhuǎn)錄升高，且隨著化合物劑量的上升，ATF-4及CHOP的蛋白表達(dá)量明顯升高，其中以CHOP蛋白更為顯著。用siRNA技術(shù)沉默HCT-116細(xì)胞中CHOP的表達(dá)，之后用不同濃度的A59處理12 h，通過免疫熒光技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)A59可以激活正常HCT-116細(xì)胞中CHOP過表達(dá)，并在CHOP沉默后無法刺激CHOP過表達(dá)，證明成功沉默CHOP（見圖4B）。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡情況（見圖4C），發(fā)現(xiàn)沉默CHOP后，A59的抗腫瘤作用減弱，說明CHOP在A59介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到了重要的作用。

圖4 A59對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道中關(guān)鍵蛋白的影響

3 討論

于天然藥物及果蔬中廣泛存在的查爾酮及其衍生物，除了有抗感染、抗氧化、抗血管等作用外[5-7]，亦被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗腫瘤能力[9]。Syam等[10]研究發(fā)現(xiàn)含有硼酸結(jié)構(gòu)的查爾酮類似物抑制乳腺癌細(xì)胞株的增殖，Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)查爾酮類似物有抗前列腺癌活性，亦有研究顯示查爾酮類似物對(duì)白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等具有一定的細(xì)胞毒性[12-13]，但其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的研究非常有限。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116是以結(jié)腸癌患者腫瘤組織為材料所建立的一種惡性結(jié)腸癌細(xì)胞株，被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，具有增殖能力強(qiáng)、血清依賴低等優(yōu)點(diǎn)，故本研究選用HCT-116細(xì)胞株在體外進(jìn)行了查爾酮類似物A59的抗腫瘤能力相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)首先使用不同濃度的A59作用于HCT-116細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)A59對(duì)HCT-116細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，致細(xì)胞生存率下降，且抑制作用強(qiáng)于查爾酮，具有濃度依賴性。并進(jìn)一步對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行了研究，使用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法發(fā)現(xiàn)A59促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡，且凋亡以早期凋亡為主。因?yàn)镃aspase3是依賴胱天蛋白酶的凋亡途徑的重要效應(yīng)者，PARP被認(rèn)為是死亡底物及凋亡早期分子標(biāo)志，而Bcl-2和Bad是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對(duì)立的一對(duì)調(diào)控蛋白[14]，因此通過Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果提示A59可以劑量依賴性促進(jìn)活性PARP以及Caspase3、Bad的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，已知Bcl-2可抑制凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活，故進(jìn)一步說明了A59促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)A59可抑制HCT-116細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。已有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞相較正常細(xì)胞多缺失G1/S限制點(diǎn)，致G2/M顯得尤為重要，被認(rèn)為是選擇性高、安全性好的藥物新靶點(diǎn)[15]。通過Western blot法分析提示A59劑量依賴性抑制細(xì)胞周期蛋白MDM2，CDC2及Cyclinb1，而Cyclinb1/CDC2是細(xì)胞周期G2/ M限制點(diǎn)的主要調(diào)控原件，故進(jìn)一步明確查爾酮類似物 A59通過阻滯細(xì)胞進(jìn)入G2/M期而抑制HCT-116細(xì)胞增殖。

引起凋亡發(fā)生的通路有很多，除了經(jīng)典的死亡受體活化及線粒體損傷傳導(dǎo)通路外，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)亦可引起細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是新的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，而CHOP則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)所致凋亡中一個(gè)非常重要的介導(dǎo)因素，細(xì)胞內(nèi)CHOP過表達(dá)可引起周期阻滯或細(xì)胞凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)通過CHOP基因敲除對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)CHOP介導(dǎo)了A59引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的細(xì)胞凋亡過程，亦說明了CHOP在凋亡中發(fā)揮了重要作用，而A59通過對(duì)CHOP調(diào)節(jié)抑制腫瘤細(xì)胞的生長，被作為腫瘤治療的特異性靶點(diǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)合成的查爾酮類化合物A59可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-113細(xì)胞生長，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道中的關(guān)鍵蛋白CHOP而發(fā)揮作用。本研究初步揭示了查爾酮類化合物A59抗結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯：胡苗苗）

Effects and mechanisms of novel chalcone analogue-A59 on inducing colon cancer cells’ apoptosis

SUN Yusheng1, ZHU Guanbao2, JIN Jinji2, TAO Lijun1, ZHU Weixing1, FANG Jun1. 1.Department of Gastroenterological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To further explore its anti-tumor activity and mechanisms through investigation of the signal path of novel chalcone analogue-A59. Methods: Synthesize the chalcone analogues and further test their cytotoxicity on colon cancer cell line (HCT-116) through MTT method, and pick out the one own better biological activity named A59. The ability of A59 on inducing HCT-116’s apoptosis and inhibiting its cell cycle were assayed using FCM method. The effect of A59 on ATF4 and CHOP expression in HCT-116 were assayed with Western blot. After knockdown CHOP by siRNA technology, the influence of A59 on cell’s apoptosis through immunofluorescence (IF) and FCM was further investigated. Results: A59 showed inhibitory effects on the proliferation of HCT-116 (IC50=7.6 μm). This novel chalcone analogue exerted its biological activity to induce HCT-116’s apoptosis and inhibit its cell cycle through FCM testing, and the Western blot assay indicated that A59 showed a dose-dependent activation of key protein CHOP of endocytoplasmic reticulum stress (ERS) signal path. and the siRNA technology further confirmed A59 induce apoptosis by stimulating the CHOP overexpression. Conclusion: Novel chalcone analogue-A59 shows inhibitory effects on the proliferation of HCT-116 by activating the ERS signal path’s key protein CHOP. Clarifies its mechanisms and shows the significance on the new anti-colon cancer drug research and development.

chalcone analogue; anti-cancer drug; cell apoptosis; CHOP

R730.5

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.007

2015-01-09

孫余?。?970-），男，浙江溫州人，副主任醫(yī)師，碩士。

朱冠保，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：zgbwmc@yahoo. com.cn。