李德周，段志良，郭江龍，王思娜，劉慧芳，王志斌，鐘曉芝，陳永平，文金生

（1.寧波市第二醫(yī)院 肝病科，浙江 寧波 315000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 蟲媒病毒研究所，浙江 溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 感染科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的構(gòu)建

李德周1，段志良2，郭江龍2，王思娜2，劉慧芳2，王志斌2，鐘曉芝2，陳永平3，文金生2

（1.寧波市第二醫(yī)院 肝病科，浙江 寧波 315000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 蟲媒病毒研究所，浙江 溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 感染科，浙江 溫州 325015）

目的：構(gòu)建丙型肝炎病毒（HCV）CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探討其體內(nèi)免疫學(xué)效應(yīng)。方法：基于我們前期從HCV中鑒定的4條HLA-A*0201限制性CTL（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）表位（NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180），2條HLA-A*1101限制性CTL表位（NS3609-617和NS5b251-259），1條HLA-A*2402限制性CTL表位（NS5b382-390）和2條Th（輔助性T細(xì)胞）表位（P73-15和NS5A276-288），合成編碼串聯(lián)CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A；陽性重組質(zhì)粒分別免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402轉(zhuǎn)基因小鼠，采用ELISPOT實(shí)驗(yàn)和CTL殺傷實(shí)驗(yàn)檢測小鼠脾細(xì)胞內(nèi)單個CTL表位特異性T細(xì)胞的水平及其殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)。結(jié)果：合成了含有Kozak序列和編碼Igκ信號鏈序列、7條CTL表位、2條Th表位的基因序列并順利克隆入了真核表達(dá)質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒免疫三種轉(zhuǎn)基因小鼠后，采用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測到小鼠脾細(xì)胞內(nèi)存在單個CTL表位特異性分泌IFN-γ的CTL，后者可殺傷負(fù)載單個CTL表位的脾細(xì)胞。結(jié)論：成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。

丙型肝炎病毒；細(xì)胞毒性T細(xì)胞；表位；DNA疫苗；小鼠

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為單股正鏈RNA病毒，其基因組翻譯3個結(jié)構(gòu)蛋白（C、E1和E2）和七個非結(jié)構(gòu)蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。HCV感染既可引起急性肝炎，也可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌[1]。據(jù)估計(jì)，目前全球有1.8億人已感染了HCV。目前，針對丙型肝炎有效的治療方法有兩種：聯(lián)合使用聚乙二醇化干擾素-α和利巴韋林及聯(lián)合使用Simeprevir和Daclatasvir，但前者只能治愈不到50%的患者，而后者高昂的價格也限制了其在大部分患者中的應(yīng)用。目前，研發(fā)有效的疫苗仍是防治HCV感染的關(guān)鍵。

大量研究表明，HCV特異性CTL（細(xì)胞毒性T細(xì)胞，活化的CD8+T細(xì)胞）反應(yīng)對于控制HCV感染和清除靶細(xì)胞內(nèi)HCV至關(guān)重要[2]。因此，基于CTL表位的新型疫苗是目前HCV疫苗研發(fā)的一個方向。在前期研究中，我們從HCV中鑒定出了7條分別受HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402限制的CTL表位[3-5]和2 條Th（輔助性T細(xì)胞，活化的CD4+T細(xì)胞）表位（尚未發(fā)表）。HLA-I類基因A基因座位的三個等位基因（HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402）在不同膚色、種族人群中總覆蓋率均超過80%。因此，含有上述三種分子限制的CTL表位的候選疫苗具有廣泛的人群覆蓋率，具有通用型。本研究擬基于我們前期鑒定的7條CTL表位和2條Th表位構(gòu)建CTL-Th表位嵌合DNA疫苗，并基于HLA轉(zhuǎn)基因小鼠研究其誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料 委托上海強(qiáng)耀多肽生物公司合成我們之前鑒定的7條CTL表位[NS4B78-86（SMMAFSAAL），NS5A367-375（TVSSALAEL），C181-189（LLSCLTTPV），NS2172-180（VLQAGLIRV），NS3609-617（ITLTHPITK），NS5B251-259（QVIRSLTER），NS5B382-390（YYLTRDPTI）]，其純度均大于95%。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A購自美國Invitrogen公司。限制性核酸內(nèi)切酶Xba I和Hind I I I購自北京艾德來生物科技有限公司。小鼠IFN-γ ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)）試劑盒購自荷蘭U-CyTech生物公司。CTL殺傷試劑盒（LDH釋放法）購自美國Promega公司。HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，HLA-A*1101轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A*2402轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Taconic公司。

1.2 CTL-Th表位嵌合基因的合成 委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成編碼多個串聯(lián)CTL表位和Th表位的基因（已進(jìn)行小鼠密碼子優(yōu)化，命名為HCV-Meg），HCV-Meg基因片段從5’端到3’端分別為保護(hù)性堿基，Xba I酶切位點(diǎn)，Kozak序列，Ig κ信號鏈序列，編碼串聯(lián)的上述9條表位和1條廣譜性Th表位（PADRE表位，序列為AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（編碼表位的核苷酸之間為編碼連接橋的核苷酸），Hind I I I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。

1.3 HCV-Meg克隆入真核表達(dá)載體 經(jīng)Xba I和Hind I I I雙酶切并回收的HCV-Meg與經(jīng)雙酶切處理并回收真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A在T4連接酶作用下連接，然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌后提取質(zhì)粒，雙酶切處理質(zhì)粒并采用1%瓊脂糖電泳。雙酶切正確的重組質(zhì)粒送公司測序以確定重組質(zhì)粒所攜帶的序列是否為完全正確的多表位串聯(lián)基因。經(jīng)雙酶切處理并電泳和測序證明正確的陽性重組質(zhì)粒[命名為pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg]用于免疫3種轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4 重組質(zhì)粒免疫轉(zhuǎn)基因小鼠 重組質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg溶于PBS液至終濃度為1 mg/mL，分別用于免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠、HLAA*1101轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A*2402轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠為6～8周齡，每種轉(zhuǎn)基因小鼠6只。50 μg重組質(zhì)粒（溶于50 μL PBS）注射到小鼠脛骨前肌內(nèi)，1周后，加強(qiáng)免疫2次（間隔1周）。第3次免疫1周后，頸椎脫臼法處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液。采用小鼠IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測脾細(xì)胞內(nèi)CTL表位特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的水平。

1.5 小鼠IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn) 采用小鼠IFN-γ ELISPOT檢測重組質(zhì)粒免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞內(nèi)CTL表位特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的水平。簡述過程如下：將上述脾細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106細(xì)胞/mL培養(yǎng)基，按照每孔100 μL的量加入預(yù)包被的ELISPOT 96孔板中并設(shè)置無肽孔（不加任何表位）和肽刺激孔（加入終濃度為20 μg/mL的不同的CTL表位）。ELISPOT板在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去每孔細(xì)胞液并洗滌每孔。每孔加入新鮮配制的生物素化的抗小鼠IFN-γ的檢測單抗，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鮮配制的HRP標(biāo)記的鏈霉親合素，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鮮配制的顯色液，于37 ℃顯色20 h。采用自來水洗板以終止反應(yīng)，采用ELISPOT讀板儀對每孔棕色斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每一個斑點(diǎn)代表1個斑點(diǎn)形成細(xì)胞（SFC），也可以說1個CTL表位特異性分泌IFN-γ 的T細(xì)胞。表位特異性T細(xì)胞的頻率表示為IFN-γ SFCs/5×105細(xì)胞。

1.6 準(zhǔn)備靶細(xì)胞 處死未免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，采用冰冷的枸櫞酸緩沖液（0.131mol/L枸櫞酸和0.666 mol/L磷酸氫二鈉，pH 3.2，4 ℃）處理脾細(xì)胞90 s，然后加入不同的CTL表位于37 ℃孵育2 h。最后，枸櫞酸處理的脾細(xì)胞和枸櫞酸處理并負(fù)載CTL表位的脾細(xì)胞作為靶細(xì)胞用于CTL殺傷實(shí)驗(yàn)。

1.7 CTL殺傷實(shí)驗(yàn) CTL殺傷實(shí)驗(yàn)[乳酸脫氫酶（LDH）釋放法]用于檢測重組質(zhì)粒免疫小鼠的脾細(xì)胞殺傷未負(fù)載CTL表位及負(fù)載CTL表位的脾細(xì)胞的效應(yīng)。按照試劑盒說明書，整個實(shí)驗(yàn)在96孔圓底培養(yǎng)板中進(jìn)行。來自重組質(zhì)粒免疫小鼠的脾細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞，枸櫞酸處理的脾細(xì)胞及枸櫞酸處理后并負(fù)載CTL表位的脾細(xì)胞作為靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)孔（Experimental）同時加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，每孔靶細(xì)胞量固定為1×104細(xì)胞（50 μL培養(yǎng)基），設(shè)置3組效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比率為10∶1，5∶1，1∶1。除了實(shí)驗(yàn)孔，還設(shè)置了效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔（ES）、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔（TS）、靶細(xì)胞最大釋放孔（TM）、容積校正孔（VC）和培養(yǎng)基背景孔（CM）。每孔總液體量為100 μL。在37 ℃孵育8 h后（第7.5小時，TM孔和VC孔加入10 μL細(xì)胞裂解液）。培養(yǎng)板于400×g離心4 min后，50 μL上清轉(zhuǎn)移到新的96孔板，加入檢測試劑，于37 ℃反應(yīng)20 min。采用酶標(biāo)儀測定液體490 nm的吸光度值。針對每個效/靶比，效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的百分殺傷率計(jì)算公式如下：

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。結(jié)果表示為mean±sD，Student t-test用于統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖 基于7條CTL表位和2條Th表位序列，合成了編碼串聯(lián)表位的CTL-Th表位嵌合基因（HCV-Meg）（經(jīng)過小鼠密碼子優(yōu)化）并擬克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A。9條表位信息見表1。HCV-Meg基因片段全長（含保護(hù)性堿基）為423 bp。如圖1-2所示：HCV-Meg基因片段從5’端到3’端分別為保護(hù)性堿基（ACA），Xba I酶切位點(diǎn)（TCTAGA），Kozak序列（GCCGCCACC），Ig κ信號鏈序列（ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTT CCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCAGGGGC），編碼串聯(lián)的上述9條表位和1條廣譜性Th表位（PADRE，AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（編碼表位的核苷酸之間為編碼連接橋的核苷酸），Hind I I I酶切位點(diǎn)（AAGCTT）和保護(hù)性堿基（TGT）。編碼的串聯(lián)表位之間的連接橋分別為“A”、“K”、“N”、“NA”、“G”、“NA”。

2.2 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖 采用Xba I和Hind I I I 對HCV-Meg和pcDNATM3.1/myc-His（-）A分別進(jìn)行雙酶切，將回收的基因片段和質(zhì)粒在T4連接酶作用下連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，提取質(zhì)粒，采用Xba I和Hind I I I雙酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。如圖3所示，第1和第4泳道為核酸marker，第2泳道為重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，第3泳道為雙酶切重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，很明顯，從重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A質(zhì)粒中雙酶切出了1 條400 bp左右的條帶，與插入的目的條帶大小一致。

表1 前期鑒定的CTL表位和Th表位的信息

圖1 CTL-Th表位嵌合基因序列

圖2 重組質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A的圖譜

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒測序圖 將上述經(jīng)雙酶切初步驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，如圖4測序結(jié)果所示：重組質(zhì)粒中插入的核苷酸序列與我們委托生物公司合成的CTL-Th表位嵌合基因序列完全一致，無堿基丟失、插入或突變。將雙酶切電泳和測序完全正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg，并大量提取該質(zhì)粒以用于后續(xù)研究。

2.4 ELISPOT結(jié)果 重組質(zhì)粒pcDNATM3.1/myc-His （-）A-DENV1-Meg分別用于免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠、HLA-A*1101轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A*2402轉(zhuǎn)基因小鼠。在最后一次免疫1周后，我們采用了ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測了重組質(zhì)粒免疫的小鼠脾細(xì)胞內(nèi)是否有單個CTL表位特異性能分泌IFN-γ的T細(xì)胞。如圖5所示，重組表位免疫的小鼠體內(nèi)有顯著高水平的表位特異性T細(xì)胞（脾細(xì)胞體外肽刺激孔與無肽刺激孔比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05）。在重組質(zhì)粒免疫的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞中NS4B78-86，NS5A367-375，C181-189，NS2172-180特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的頻率分別為56±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞，86±9 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞，45±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞，62±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞；在重組質(zhì)粒免疫的HLA-A*1101轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞中NS3609-617，NS5B251-259特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的頻率分別為34±9 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞和14±6 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞；在重組質(zhì)粒免疫的HLA-A*2402轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞中NS5B382-390特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的頻率為43±4 IFN-γ SFCs/5×105脾細(xì)胞。

2.5 CTL殺傷結(jié)果 如圖6所示，重組質(zhì)粒免疫的小鼠的脾細(xì)胞可特異性殺傷負(fù)載單個CTL表位的脾細(xì)胞，其百分殺傷率與效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比率成正比。當(dāng)效靶比為10∶1時，重組質(zhì)粒免疫的小鼠的脾細(xì)胞對負(fù)載NS4B78-86、NS5A367-375、C181-189、NS2172-180、NS3609-617、NS5B251-259、NS5B382-390的脾細(xì)胞的百分殺傷率分別為（15.12±5.23）%、（22.63±7.76）%、（14.08±4.93）%、（20.95±6.75）%、（8.41±3.98）%、（6.28±3.21）%、（13.47±4.23）%。

3 討論

目前，丙型肝炎的危害依然非常嚴(yán)重。因此，開發(fā)防治性疫苗仍是目前丙型肝炎的研究熱點(diǎn)?？紤]到CTL在防治丙型肝炎中發(fā)揮重要作用，基于高度保守的CTL表位的新型疫苗（尤其是DNA疫苗）非常具有吸引力。在前期的大量原創(chuàng)性研究中，我們從HCV中鑒定了7條高度保守的受HLA-A*0101、HLAA*1101、HLA-A*2402限制的CTL表位和2條Th表位。因此，基于上述表位的疫苗（尤其是CTL-Th表位嵌合DNA疫苗）具有潛在的應(yīng)用價值。

圖4 重組質(zhì)粒的測序圖

圖5 重組質(zhì)粒免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)表位特異性T細(xì)胞反應(yīng)

圖6 重組質(zhì)粒免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)表位特異性CTL反應(yīng)

大量研究已證實(shí)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗可誘導(dǎo)更廣泛的免疫反應(yīng)，而且誘導(dǎo)的反應(yīng)也強(qiáng)于全蛋白疫苗。但該類疫苗能否誘導(dǎo)免疫反應(yīng)取決于多個因素：編碼表位的基因能否啟動表達(dá)，表達(dá)的串聯(lián)表位能否進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，串聯(lián)表位能否被宿主的蛋白酶體裂解并釋放出單個表位。目前對于此類疫苗的構(gòu)建模式已形成共識，即該DNA疫苗中應(yīng)攜帶Kozak序列，Ig κ鏈信號序列，編碼廣譜性Th表位（PADRE）的基因序列，編碼單個表位的序列之間由編碼連接橋的序列相連。因?yàn)镵ozak序列能啟動基因表達(dá)，并能增強(qiáng)多個CTL表位表達(dá)的準(zhǔn)確性和效率[6]。Ig κ鏈信號序列則可介導(dǎo)編碼的串聯(lián)CTL表位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)而進(jìn)行了內(nèi)源性抗原的HLA-I類分子加工途徑[7]。研究表明廣譜性Th表位（PADRE表位）輔助特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生，PADRE可增強(qiáng)疫苗的免疫效應(yīng)，其對于T細(xì)胞表位疫苗研發(fā)不可或缺，PADRE的免疫原性強(qiáng)于普通的T細(xì)胞表位[8]。多個CTL表位的排列直接影響單個CTL表位能否釋放出來并誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，研究表明在CTL表位間引入連接橋不但有助于單個CTL表位的加工和釋放，而且不會導(dǎo)致新的CTL表位的產(chǎn)生[6]。因此，為了更好設(shè)計(jì)HCV多表位DNA疫苗，我們充分考慮了我們鑒定的9個表位的排列順序以實(shí)現(xiàn)：①蛋白酶體只在每個表位的羧基端裂解；②不產(chǎn)生新序列的肽段。并且我們采用兩種蛋白酶體裂解軟件預(yù)測肽的加工[9]以確保我們構(gòu)建的DNA疫苗編碼的串聯(lián)表位能被小鼠蛋白酶體加工釋放出單個表位。密碼子優(yōu)化有助于基因在選定宿主中高效表達(dá)，我們也相應(yīng)地對所構(gòu)建的串聯(lián)表位基因進(jìn)行了小鼠密碼子優(yōu)化。本研究中，我們嘗試構(gòu)建了能編碼上述表位的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并采用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠探討了其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)本研究所構(gòu)建的DNA疫苗免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠后可誘導(dǎo)單個CTL表位特異性的CTL反應(yīng)。這說明此DNA疫苗可在小鼠組織內(nèi)表達(dá)串聯(lián)表位，后者可被小鼠蛋白酶體切割釋放出單個的CTL表位進(jìn)而誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。

近年來，國內(nèi)外研究人員曾嘗試構(gòu)建了HCV的CTL表位串聯(lián)DNA疫苗[10-12]，并證實(shí)了此類疫苗可誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。與他們的研究相比，我們的研究具有以下特點(diǎn)：①我們構(gòu)建的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗所編碼的CTL表位具有廣泛的人群覆蓋率，其總的人群覆蓋率可達(dá)到80%以上；②我們構(gòu)建的疫苗編碼的CTL表位在HCV中具有高度保守性；③我們構(gòu)建的疫苗可誘導(dǎo)針對所能編碼的所有單個CTL表位特異性的CTL反應(yīng)。我們今后將進(jìn)一步優(yōu)化此DNA疫苗，使其能夠編碼更多的具有廣泛人群覆蓋率的CTL表位，并探討此類疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)。

[1]Dubuisson J, Cosset FL.Virology and cell biology of the hepatitis C virus life cycle-An update[J].J Hepatol, 2014, 61(1S): S3-S13.

[2]Heim MH, Thimme R.Innate and adaptive immune responses in HCV infections[J].J Hepatol, 2014, 61(1S): S14-S25.

[3]段志良, 張麗芳, 張琴, 等.丙型肝炎病毒CTL表位的HLAA2限制性及其免疫學(xué)效應(yīng)研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2009, 29(9): 822-826.

[4]陳俊, 段志良, 鞏文詞, 等.人白細(xì)胞抗原-A*0201限制性丙型肝炎病毒細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的鑒定[J].中華傳染病雜志, 2010, 28(11): 651-655.

[5]鐘曉芝, 段志良, 郭江龍, 等.丙型肝炎病毒HLA-A*1101 和A*2402限制性CD8+T細(xì)胞表位的研究[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 44(8): 547-554.

[6]Wei H, Lenz SD, Thompson DH, et al.DNA-vaccine platform development against H1N1 subtype of swine infuenza A viruses[J].Viral Immunol, 2012, 25(4): 297-305.

[7]Hayashi A, Wakita H, Yoshikawa T, et al.A strategy for efficient cross-presentation of CTL-epitope peptides leading to enhanced induction of in vivo tumor immunity[J].J Control Release, 2007, 117: 11-19.

[8]Polakova I, Duskova M, Smahel M.Antitumor DNA vaccination against the Sox2 transcription factor[J].Int J Oncol, 2014, 45(1): 139-146.

[9]Kesmir C, Nussbaum A, Schild H, et al.Prediction of proteasome cleavage motifs by neural network[J].Prot Eng, 2002, 15: 287-296.

[10] Memarnejadian A, Roohvand F, Arashkia A, et al.Polytope DNA vaccine development against hepatitis C virus: a streamlined approach from in silico design to in vitro and primary in vivo analyses in BALB/c mice[J].Protein Pept Lett, 2009, 16(7): 842-850.

[11] Memarnejadian A, Roohvand F.Fusion of HBsAg and prime/boosting augment Th1 and CTL responses to HCV polytope DNA vaccine[J].Cell Immunol, 2010, 261(2): 93-98.

[12] Shi L, Liu S, Fan GX, et al.Effective induction of type 1 cytotoxic T cell responses in mice with DNA vaccine encoding two hepatitis C viruscytotoxic T lymphocyte epitopes[J].Viral Immunol, 2006, 19(4): 702-711.

（本文編輯：吳健敏）

Construction of hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine

LI Dezhou1, DUAN Zhiliang2,GUO Jianglong2, WANG Sina2, LIU Huifang2, WANG Zhibin2, ZHONG Xiaozhi2, CHEN Yongping3, WEN Jinsheng2.1.Department of Liver, the Second Hospital of Ningbo, Ningbo, 315000; 2.Institute of Arboviruses, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of Infection, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To construct hepatitis C virus (HCV) CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine and explore its in vivo immune response.Methods:Based on previously identified four HCV-specific HLAA*0201-restricted CTL (Cytotoxic T Lymphocyte) epitopes (NS4b_78, NS5a_367, C_181 and NS2_172), two HLA-A*1101-restricted CTL epitopes (NS3_609 and NS5b_251), one HLA-A*2402-restricted CTL epitopes (NS5b_382) and two Th epitopes (P73-15and NS5A276-288), the gene encoding chimeric CTL epitopes and Th epitopes was synthesized and cloned into eukaryotic expressing vector pcDNATM3.1/myc-His(-) A.The recombinant plasmid was used to immunize HLA-A*0201, HLA-A*1101 and HLA-A*2402 transgenic mice, ELISPOT and CTL cytotoxicity assay were used to measure the frequencies of CTL epitope-specifc T cells in splenocytes of mice and the cytotoxic activity of CTL against target cells.Results: The gene containing Kozak sequence and encoding Igκ chain signal sequence, seven CTL epitopes, two Th epitopes was successfully cloned into eukaryotic expressing vector.Recombinant plasmid immunization elicited epitope-specifc IFN-γ-secreting T cells which could lyse CTL epitope-pulsed splenocytes.Conclusion:A Hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine which can induce epitope-specifc CTL response is successfully constructed.

hepatitis C virus; cytotoxicity T lymphocyte; epitope; DNA vaccine; mice

R373.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.001

2014-10-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31070143）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY13H160035）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C33261）；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A610247）。

李德周（1980-），男，浙江瑞安人，主治醫(yī)師，碩士。

文金生，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wjs78@wmu.edu.cn。