朱良玉，張 悅

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150040）

咖啡酸修飾篤斯越橘花色苷的實(shí)驗(yàn)分析

朱良玉，張 悅*

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150040）

應(yīng)用超聲波萃取法提取大興安嶺篤斯越橘花青素，通過提純、上柱、濃縮得到純化后的花色苷，以空白花色苷為對照，設(shè)計(jì)將其與咖啡酸、咖啡酸加酶兩組?；磻?yīng)，比較分析花色苷的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，50℃持續(xù)加熱狀態(tài)下96 h后花色苷對照組保存率77.26%、不加酶組81.00%、加酶組84.96%?？Х人嵩诿傅拇呋驴梢悦黠@提高篤斯越橘花青素的穩(wěn)定性。

篤斯越橘；咖啡酸；?；换ㄉ?/p>

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）屬杜鵑花科越橘屬植物，起源于北美，為多年生灌木小漿果果樹。因果實(shí)呈藍(lán)色，故稱為藍(lán)莓。其含有的大量水溶性色素花色苷，具有抗氧化、抗突變、降血糖、軟化血管、清除自由基等作用，有極高的藥用、保健和營養(yǎng)價(jià)值，從食品添加劑角度又具有較高的市場和商業(yè)價(jià)值。近年來，天然食品添加劑越來越受到人們的關(guān)注，花色苷的穩(wěn)定性是食品加工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵，因此提高花色苷穩(wěn)定性的研究始終是花色素研究的熱點(diǎn)，目前該研究方法主要是分子修飾法，而?；ㄊ欠肿有揎椃ǖ囊环N。

花色苷?；耐緩街饕谢瘜W(xué)?；?、酶促?；?。化學(xué)?；枰鞣N?；w，主要有酸類、酯類以及酸酐等。有研究報(bào)道表明，添加一定量篩選出的肉桂酸、咖啡酸和阿魏酸后，剌葡萄皮花色素的吸光度值明顯增加，最大吸收波長紅移，對溫度、光照的耐受性增強(qiáng)[1]。盧鋒波[2]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咖啡酸對黑莓酒具有輔色作用，表現(xiàn)為可見光范圍內(nèi)最大吸收值13.51%～19.19%的增加。董楠等[3]研究表明，咖啡酸的添加能明顯提高色素溶液在光（自然和紫外）、熱以及不同金屬離子條件下的穩(wěn)定性，且隨咖啡酸濃度的增加其穩(wěn)定效果加強(qiáng)。

酶促酰化因酶對于催化底物良好的專一性和選擇性，反應(yīng)條件溫和，催化作用高效，因而酶促法分子修飾發(fā)展非常迅速。有報(bào)道表明，以保存率為評價(jià)指標(biāo)，通過時(shí)間、比例、溫度和pH的單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化，選擇對羥基苯甲酸作為?；w，進(jìn)行酶促?；に囇芯靠墒顾{(lán)靛果花色苷保存率達(dá)93.51%[4]。趙壘[5]研究表明，將花色苷樣品與酰基供體在非水環(huán)境中以Novozyme435酶（固定化脂肪酶435）為催化劑進(jìn)行酰化反應(yīng)可提高平陰玫瑰花花色苷穩(wěn)定性。

該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超聲波方法提取大興安嶺篤斯越橘花青苷，上柱純化后對花青苷進(jìn)行分子修飾，采用咖啡酸作為酸供體，加入Novozyme435酶促進(jìn)其?；行岣呋ㄉ盏姆€(wěn)定性，為篤斯越橘花色苷分子修飾和花色苷穩(wěn)定性提高的研究和生產(chǎn)，提供相關(guān)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘：采自大興安嶺；

咖啡酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、Novozym435脂肪酶（活力10 000 PLU/g）、X-5樹脂：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-5200超聲波破碎儀：北京益植康生物科技有限公司；T6紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用公司；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝儀器公司；FD-1A-50凍干機(jī)：上海申勝儀器公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋：北京醫(yī)療電子儀器廠；FJ-200高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷材料的制備

正常室溫環(huán)境中，將準(zhǔn)確稱量的50 g大興安嶺篤斯越橘打碎成汁液，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇1 000 m L浸提；溫度30℃、超聲波功率80 W條件下超聲萃取20 min，4層紗布過濾后，澄清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用X-5樹脂上柱，用蒸餾水洗脫至無色后，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫得到澄清深紅色液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到花色苷濃縮液，凍干備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作

咖啡酸修飾花色苷?；瘜?shí)驗(yàn)：精確稱量0.005 g花色苷凍干樣品，花色苷與咖啡酸以質(zhì)量比1∶5混合，溶于10 m L無水乙醇中，室溫條件下振蕩20 min充分溶解，加入0.1 g Novozyme435酶（固定化脂肪酶435），在45℃條件下水浴6 h進(jìn)行?；磻?yīng)，反應(yīng)中止后4層紗布過濾脂肪酶，記為咖啡酸加酶組A 1。在以上步驟中去除加酶環(huán)節(jié)，未加酶記為咖啡酸組A2，以不加咖啡酸為空白組A3。

花色苷老化試驗(yàn)：將以上3組實(shí)驗(yàn)樣品分別置于10 m L試管內(nèi)，于50℃水浴鍋內(nèi)加熱96 h。用紫外-可見分光光度法測定樣品吸光度值，每24 h測定一次。

1.3.3 花色苷穩(wěn)定性分析

提高花色苷的穩(wěn)定性是通過減緩花色苷分解速率來實(shí)現(xiàn)的，花色苷分解速率越慢說明其穩(wěn)定性越高，花色苷分解速率可以通過其保存率來體現(xiàn)，設(shè)咖啡酸與花色苷?；磻?yīng)結(jié)束時(shí)為測量始期，花色苷保存率計(jì)算公式如下：

保存率=（An/A0）×100%

式中：A0為花色苷溶液的初始吸光度值；An為加熱n小時(shí)后花色苷溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各實(shí)驗(yàn)組花色苷吸光度值的變化

咖啡酸與花色苷酰化反應(yīng)結(jié)束時(shí)為測量始期，同一環(huán)境、加溫條件下的咖啡酸加酶組A1、咖啡酸組A2和空白組A3在96 h內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組花色苷吸光度值的變化結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在50℃加熱狀態(tài)下，各組花色苷的吸光度值隨著加熱時(shí)間的增長而減小，48 h后吸光度值下降相對變得平緩，花色苷吸光度值大小與加熱時(shí)間成反比，隨時(shí)間的延長吸光度值呈逐漸下降趨勢。A 1組花色苷吸光度值較A3組大幅度減小，A2組吸光度值最高。結(jié)果表明，咖啡酸對大興安嶺篤斯越橘花色苷具有輔色作用，Novozyme435酶的加入對花色苷的吸光度值有一定抑制作用，可能是產(chǎn)生了其他化學(xué)反應(yīng)。

圖1 各組花色苷96 h內(nèi)吸光度值變化比較Fig.1 Absorbance values comparison of anthocyanins in 96 h

2.2 各實(shí)驗(yàn)組花色苷保存率的變化

根據(jù)50℃加熱狀態(tài)下96 h的吸光度值計(jì)算3組的保存率，結(jié)果見表1。

表1 花色苷保存率結(jié)果Tab le1 Results o f anthocyanin preservation rate

由表1可知，同一環(huán)境、50℃加熱狀態(tài)下，24 h A1組保存率高于A2組低于A3組，之后保存率一直比其他兩組高，96 h達(dá)到84.96%，比A3組高7.7%；A2組保存率介于其他兩組中間，96 h后達(dá)到81.00%；A 3組24 h保存率最高98.22%，96 h后下降至77.26%。結(jié)果表明，咖啡酸的加入提高了大興安嶺篤斯越橘的花色苷的穩(wěn)定性，加入Novozyme435酶后花色苷的保存率有進(jìn)一步的提升。

3 結(jié)論

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了咖啡酸修飾花色苷時(shí)，在酶的催化作用下提高花色苷穩(wěn)定性效果較為顯著，在50℃加熱狀態(tài)下96h后保存率為84.96%，穩(wěn)定性高于不加酶組和空白組。

50℃加熱狀態(tài)下通過時(shí)間的增加測試花色苷的吸光度值和保存率主要是考察時(shí)間對花色苷的穩(wěn)定性影響，在加速花色苷分解的同時(shí)考察花色苷對50℃溫度的抗性，實(shí)驗(yàn)證明在加入咖啡酸后花色苷穩(wěn)定性提高，但是酶的加入減少了花色苷的吸光度值。

酶對于花色苷的分子修飾具有選擇性，咖啡酸加酶提高了花色苷的穩(wěn)定性卻降低了其吸光度值，可能是因?yàn)槊概c花色苷生成了其他物質(zhì)，減少或遮蔽了花色苷的某些基團(tuán)，其抗氧化功能是否也有所變化有待于化學(xué)結(jié)構(gòu)、成分分析等方面的深入研究。本實(shí)驗(yàn)加酶修飾后的花色苷穩(wěn)定性明顯增高，證明了酶促法可以有效的提高花色苷穩(wěn)定性。

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醬油背后的秘密

最近十年，雞精、醬油、醋、醬、復(fù)合調(diào)味料等行業(yè)都得到了快速發(fā)展，催生醬油行業(yè)急速成長的原因總結(jié)下來可能主要是以下幾點(diǎn)：

1不以價(jià)格為局限，以品質(zhì)提升、消費(fèi)者口感為追求

市場啟動(dòng)前，傳統(tǒng)醬油4～5元/瓶的產(chǎn)品就算高檔產(chǎn)品，市場大量的袋裝、散裝及2～3元左右產(chǎn)品是主流?？墒沁@些醬油企業(yè)幾乎都沒有被原有的市場價(jià)格所局限，通過分析，發(fā)現(xiàn)消費(fèi)者對醬油功能的關(guān)注已經(jīng)從調(diào)色轉(zhuǎn)移到增加鮮味、提升口感上。而滿足這些要素生產(chǎn)出來的醬油往往在上市初期都是走高檔路線，在得到消費(fèi)者初步認(rèn)可后，慢慢走向大眾化，漸漸成為常規(guī)性產(chǎn)品。海鮮醬油是當(dāng)時(shí)很多企業(yè)積極嘗試的一個(gè)新產(chǎn)品，這是酵母抽提物和其他鮮味劑進(jìn)入醬油的一個(gè)起步。

2勇于接受并使用新技術(shù)、新設(shè)備

傳統(tǒng)醬油生產(chǎn)大多使用缸或池，生產(chǎn)的穩(wěn)定性、大規(guī)模復(fù)制性都受到局限。為了穩(wěn)定品質(zhì)、便于大規(guī)模擴(kuò)張，大罐發(fā)酵成為必然選擇，日式高鹽稀態(tài)工藝的大罐精準(zhǔn)控制優(yōu)勢顯現(xiàn)無疑。此外伴隨高鹽稀態(tài)工藝進(jìn)入醬油工廠的是醬油酵母等有益功能微生物的使用。其實(shí)醬油酵母在工廠的應(yīng)用并不陌生，只是一直沒有得到明確的行業(yè)內(nèi)宣傳，存在很多認(rèn)識上的誤區(qū)。

為了結(jié)合市場需求和行業(yè)發(fā)展趨勢，研發(fā)出醬油活性干酵母，其開發(fā)歷程可以劃為四個(gè)階段：

第一階段：2010年初國內(nèi)首次生產(chǎn)出醬油活性干酵母時(shí)，對于菌種的性能都尚未完全了解。伴隨著工廠的應(yīng)用摸索，對酵母的耐溫、耐鹽等性能有了進(jìn)一步掌握。

第二階段：由于缺乏可以借鑒的經(jīng)驗(yàn)，醬油活性干酵母的添加時(shí)間、用量以及酵母之間拮抗反應(yīng)等問題通過反復(fù)的應(yīng)用，最終摸索出來適宜的應(yīng)用工藝。

第三階段：大批醬油工廠的發(fā)酵驗(yàn)證，為不同酵母菌種的代謝產(chǎn)物分析做了充分驗(yàn)證，濃郁風(fēng)格、淡雅風(fēng)格等差異化需求日漸凸顯。

第四階段：很多醬油酵母并非常規(guī)釀酒酵母屬，是魯氏酵母，該類酵母在制備成為干酵母后，常溫條件下無法進(jìn)行長時(shí)間的存儲，酵母活力下降快，這直接影響了醬油酵母的使用效果。研究人員嘗試使用包埋技術(shù)、鮮酵母、半干酵母、冷凍干燥等，都沒有得到理想效果。直到研究人員找到酵母激活因子解決生長問題，用干酵母冷凍儲存才徹底消除了醬油酵母應(yīng)用通路上的最后一個(gè)瓶頸。

摘自安琪酵母股份有限公司信息

Experimental analysis of blueberry anthocyanins modified with caffeic acid

ZHU Liangyu,ZHANG Yue*
(Institute of Nature Resources,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China)

The anthocyanin of Vaccinium uliginosum from Greater Khingan was extracted by ultrasonic,and then it was purified by purification, column,and concentration.Using blank anthocyanin as control,the anthocyanin was added with caffeic acid and caffeic acid enzyme respectively to conduct acylation reaction,and the stability of anthocyanins was compared.Results showed that after heating at 50℃for 96 h,the anthocyanin preserving rate of the control group,without enzyme group and enzyme group was 77.26%,81.00%and 84.96%,respectively.Caffeic acid can obviously improve the stability of blueberry anthocyanins catalyzed by enzymes.

blueberry;coffee acid;acylation;anthocyanin

Q946.5

A

0254-5071（2015）03-0130-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.031

2015-01-13

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金（ZRS20120531）；黑龍江省財(cái)政廳應(yīng)用技術(shù)研究專項(xiàng)（kxy20121220）

朱良玉（1984-），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。

*通訊作者：張悅（1962-），男，研究員，本科，研究方向?yàn)橹参镔Y源。