楊 平，衣雪竹，曹文濤

（1.大連百傲化學股份有限公司，遼寧大連116038；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003）

紅汁乳菇菌絲體發(fā)酵過程的參數(shù)變化及發(fā)酵終點的確定

楊 平1，衣雪竹1，曹文濤2

（1.大連百傲化學股份有限公司，遼寧大連116038；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003）

研究了紅汁乳菇菌絲體搖瓶發(fā)酵過程中菌絲體形態(tài)、干質(zhì)量、pH、還原糖含量、蛋白酶活等變化趨勢，綜合分析確定發(fā)酵終點。結(jié)果顯示，各項指標對發(fā)酵培養(yǎng)過程控制均具有指示性，在培養(yǎng)6 d時蛋白酶活達到峰值0.65 U，菌絲干質(zhì)量也達到較高值0.48 g/100 m L，其他指標變化趨勢也提示可在此時間結(jié)束發(fā)酵。

紅汁乳菇菌絲體；參數(shù)變化；發(fā)酵終點

紅汁乳菇（Lactarius hatsudake）是一種美味食用菌，富含蛋白質(zhì)、有機酸、核苷酸、多糖、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗菌活性，但因其是植物外生菌根菌，目前尚無法人工栽培出菇[1-2]。運用深層培養(yǎng)的方式培養(yǎng)菌絲體是近年來食用菌生產(chǎn)的新途徑，其特點是生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大，一年四季可以穩(wěn)定供應。通過深層培養(yǎng)可以大量生產(chǎn)菌絲體，再從菌絲體和發(fā)酵醪液中提取抗腫瘤多糖、有機酸、核酸、抗生素、香味物質(zhì)和具生物活性的代謝產(chǎn)物等。目前在紅汁乳菇菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)研究中，多涉及培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件的優(yōu)化[3-8]，菌絲體營養(yǎng)成分的分析和多糖提取等[9-12]，對培養(yǎng)過程中菌絲體主要生理指標的報道與終點確定的關(guān)系少有報道。結(jié)合近年來對食用菌液體發(fā)酵動態(tài)及終點判定的研究，對紅汁乳菇培養(yǎng)過程中的菌絲體形態(tài)、干質(zhì)量、pH、還原糖、蛋白酶活等參數(shù)變化進行了檢測分析[13-16]，為菌絲體放大生產(chǎn)的過程控制及發(fā)酵終點判定提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌種

實驗菌種為野生紅汁乳菇子實體中分離馴化得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水大約1 000 m L煮沸0.5 h，兩層紗布過濾，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，加水補至1 000 m L，121℃滅菌20 min左右后取出分裝備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：采用實驗優(yōu)化培養(yǎng)基，果糖30.253 g/L，蛋白胨3.576 g/L，K2HPO42.5 g/L。

1.2 儀器與設備

BJ-1CD超凈工作臺、YXQ-LS-50SII高壓滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-2500紫外分光光度計：日本島津公司；TDL80-2B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；ECLIPSE-E200顯微鏡：日本Nikon公司；ZHWY-111B恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；DZF-0真空干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；AG135梅特勒-托利多天平：上海梅特勒儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶菌絲體培養(yǎng)

用250m L三角瓶分裝優(yōu)化培養(yǎng)基，每瓶裝液量為60m L，0.12 MPa、121℃滅菌30 min，冷卻后接入培養(yǎng)3 d的液體菌種，27℃、140 r/min搖床培養(yǎng)10 d，每天取一瓶做各項指標檢測及形態(tài)觀察。

1.3.2 菌絲干質(zhì)量的測定

將發(fā)酵液于3 000 r/min離心15 min。棄去上清液，用蒸餾水清洗沉淀的菌絲體后再離心分離，重復2次，將沉淀的菌絲體于40℃下真空干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.3.3 菌絲形態(tài)觀察

取發(fā)酵不同天數(shù)的菌絲體進行肉眼及鏡下觀察，鏡下觀察先壓片染色（石炭酸-美蘭），在100倍顯微鏡下觀察并選取形態(tài)顯著的菌絲拍片。

1.3.4 理化指標的測定

pH值：用pH計測量；黏度：用黏度計測量。

發(fā)酵濾液OD值測定：取離心發(fā)酵濾液，用分光光度計在波長540 nm處測OD值。

還原糖的測定：取離心發(fā)酵濾液，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定發(fā)酵濾液還原糖。

胞外蛋白酶活的測定：取50 mg酪蛋白作為底物，添加4.9 m L 0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）及0.1 m L發(fā)酵濾液混合，37℃水浴反應20 min，加0.5 m L 50%三氯醋酸溶液后終止反應，混合液經(jīng)過濾于波長280 nm處測定吸光度值，以煮沸的發(fā)酵濾液作空白對照。酶活力單位定義為1 U=△OD/（min·m L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間紅汁乳菇菌絲體的外觀及鏡檢形態(tài)

對菌絲形態(tài)的觀察可以更加直觀地了解發(fā)酵的進程及變化，為發(fā)酵培養(yǎng)及其控制提供依據(jù)。發(fā)酵過程中菌絲體外觀以及形態(tài)分別見圖1及圖2。

圖1 發(fā)酵過程中菌絲體外觀Fig.1 Mycelia appearance in fermentation process

圖2 發(fā)酵過程中菌絲體形態(tài)Fig.2 Morphology of mycelia in fermentation process

由圖1可知，菌絲體發(fā)酵初期（1 d）時呈白色羽毛狀，分散于培養(yǎng)液中。隨著發(fā)酵的進行，菌絲逐漸濃稠形如絮狀，菌體分泌色素使菌絲顏色變?yōu)闇\棕色，發(fā)酵液的顏色也隨之加深。隨著培養(yǎng)時間增加，菌絲體的大量生長使發(fā)酵液也越來越黏稠，且發(fā)酵液產(chǎn)生濃郁的香味，說明此時代謝產(chǎn)生了大量芳香類營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)后期（6 d）菌絲部分呈片狀，菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。取發(fā)酵菌絲體壓片鏡檢，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時間點發(fā)酵菌絲有很大不同。由圖2可知，培養(yǎng)初期（1 d）菌絲分枝較少，且分枝很短，菌絲分散性較好，菌絲發(fā)酵中期（3 d）時菌絲分枝增長加粗，菌絲交織成網(wǎng)狀，相互纏繞、聚集，但并未形成菌絲球，發(fā)酵至后期（6 d）菌絲出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，鏡下可以看到菌體的殘渣。結(jié)果表明，發(fā)酵3 d時菌絲外觀形態(tài)及鏡下均顯示菌絲尚處于生長旺盛階段，發(fā)酵6 d時菌絲外觀顏色最深，鏡下出現(xiàn)菌體殘渣提示發(fā)酵已近終點。

2.2 紅汁乳菇發(fā)酵培養(yǎng)過程各項參數(shù)的變化趨勢

菌絲體干質(zhì)量及發(fā)酵液OD值常用來恒量發(fā)酵生物量，發(fā)酵液黏度也可間接反映出發(fā)酵過程中菌絲體濃度及發(fā)酵液傳質(zhì)能力，這些指標變化與菌體生長和產(chǎn)物生成有著重要的關(guān)系。發(fā)酵過程中菌絲干質(zhì)量、發(fā)酵液黏度及OD值的變化見圖3。發(fā)酵過程中pH值、還原糖及蛋白酶活的變化見圖4。

圖3 發(fā)酵過程中菌絲干質(zhì)量、發(fā)酵液黏度及OD值的變化Fig.3 Variation of mycelial dry weight,broth viscosity and OD in fermentation process

由圖3可知，接入紅汁乳菇液體菌種發(fā)酵很快進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)1～3 d時菌絲干質(zhì)量增長迅速，4～6 d時生長速率變慢，7 d菌絲干質(zhì)量達到峰值0.56 g/100 m L，之后菌絲干質(zhì)量開始下降；發(fā)酵液的OD值和黏度在培養(yǎng)1～7 d內(nèi)都呈上升的趨勢，發(fā)酵7 d黏度達到205 mPa·s，是初期的4倍多，7 d后菌體開始老化，菌絲體分解導致發(fā)酵液黏度下降，發(fā)酵液OD值8 d時達0.27，之后上升趨勢不明顯。從菌絲干質(zhì)量、發(fā)酵液黏度及OD值三者的變化總體趨勢來看，前兩者均在7 d達到峰值，而OD值7 d后仍有上升，可能是菌絲體生長過程中有色素產(chǎn)生所致，故可在培養(yǎng)6～7 d時結(jié)束發(fā)酵。

圖4 發(fā)酵過程中pH值、還原糖及蛋白酶活的變化Fig.4 Variation of pH,reducing sugar and protease activity in fermentation process

由圖4可知，發(fā)酵液的pH值在1～4 d內(nèi)持續(xù)下降，從5.8降至4.4，此時菌絲體生長過程中有大量的酸性物質(zhì)生成，且生成速率較快，提示菌絲體生長旺盛，之后pH值趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵整個過程中，還原糖的含量呈整體下降趨勢，這與菌絲生長代謝需消耗糖類物質(zhì)呈正相關(guān)，1～6 d糖利用速度較快，發(fā)酵6 d時消耗近一半糖量，7 d后糖消耗速率放慢，提示發(fā)酵進入后期；在2～3 d時蛋白酶活性急劇升高，發(fā)酵6 d時活性最大，之后急劇下降至初期水平，提示培養(yǎng)液中蛋白已幾盡消耗。從以上三個指標變化來看，蛋白酶活力值對發(fā)酵終點的判斷有顯著的指示性，可據(jù)此將6 d作為發(fā)酵終點。

從發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化趨勢來看，菌體產(chǎn)生的色素干擾使OD值在測定生物量時有偏差，故在發(fā)酵放大生產(chǎn)中可將菌絲體干質(zhì)量和發(fā)酵液黏度作為判斷發(fā)酵液生物量的指標，而發(fā)酵液中還原糖、蛋白酶活及pH值的變化直接反應了原料消耗及菌絲體的發(fā)酵代謝情況，可根據(jù)指標變化適時結(jié)束培養(yǎng)或補料增加培養(yǎng)時間，獲得更多的生物量或代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

綜上結(jié)果，液體菌種接入搖瓶后可以快速進入增殖期（第1～第4天），新的菌絲片段不斷產(chǎn)生，菌絲干質(zhì)量及發(fā)酵液黏度、OD值均顯著增加，糖類物質(zhì)被迅速地分解，蛋白酶活性不斷增大，第6天達到高峰，說明此時的菌絲體活力最高。在發(fā)酵進行到第7天時菌絲干質(zhì)量及發(fā)酵液黏度均達到最大值，之后開始下降。結(jié)合形態(tài)學觀察，發(fā)酵第6天后菌體開始衰老，鏡下可以檢出菌體自溶現(xiàn)象，指示菌體的生長與代謝處于較低狀態(tài)，應及時終止發(fā)酵。綜合分析，發(fā)酵1～4 d為紅汁乳菇液體菌種的快速增殖期，此階段菌絲生長處于旺盛期，可用于接種，而搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的終點應控制在第6天。

本試驗通過對紅汁乳菇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程中菌絲干質(zhì)量、黏度、pH、糖量及蛋白酶活等指標的檢測分析，為發(fā)酵終點的判斷和發(fā)酵過程的控制提供了技術(shù)參數(shù)，為紅汁乳菇菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的進一步放大及生產(chǎn)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Parameter changes of Lactarius hatsudake mycelia fermentation and determination of the fermentation end-point

YANG Ping1,YI Xuezhu1,CAO Wentao2
(1.Dalian Bio-Chem Co.,Ltd.,Dalian 116038,China;2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy, Guiyang 550003,China)

The changes of Lactarius hatsudake mycelia morphology,dry weigh,pH,reducing sugar content,protease activity was studied during shake flask fermentation,and the fermentation end-point was analyzed and determined.The results showed that the above indicators could guide for controlling the fermentation,some indexes indicating that 6 d was the optimum fermentation end-point when the protease activity reached the peak of 0.65 U,and mycelia dry weight reached 0.48 g/100 m l.The change of other indicators also pointed out that 6 d was the fermentation end-point.

Lactarius hatsudake mycelia;parameter changes;fermentation end-point

Q939.9

A

0254-5071（2015）03-0115-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.027

2015-01-16

貴州省科學技術(shù)基金項目[黔科合J字（2008）2088]

楊平（1973-），女，工程師，碩士，主要從事微生物應用研究。