邢 佳，陸文娟，趙云霞，陶明煊

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

石榴葉多酚對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

邢 佳，陸文娟，趙云霞，陶明煊*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

目的：探究石榴葉多酚對(duì)酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：將60 只小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，石榴葉多酚2低、中、高劑量組（100、200、400 mg/（kg·d））和陽性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯滴丸，150 mg/（kg·d）），每組10 只?？瞻捉M與模型組小鼠灌胃去離子水（0.1 mL/（10 g·d）），連續(xù)灌胃30 d；第31天，除空白組外，其余組小鼠均灌胃50%乙醇（12 mL/kg）建立急性肝損傷模型，12 h后，取小鼠眼球血清測(cè)定生化指標(biāo)，取肝臟觀察肝組織的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：模型組小鼠肝臟天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）活力及血清中甘油三酯（triglyceride，TG）水平、ALT和AST活力明顯升高，亞顯微觀察顯示小鼠肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常，線粒體畸形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上附著的核糖體脫落，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴；隨著給藥劑量的增加，石榴葉多酚2各劑量組對(duì)上述情況的改善作用也不斷加強(qiáng)。結(jié)論：石榴葉多酚2對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

石榴葉多酚；急性酒精性肝損傷；生化指標(biāo)；超微結(jié)構(gòu)

肝臟是酒精代謝的主要器官，酒精對(duì)肝細(xì)胞的直接作用將導(dǎo)致酒精性肝病[1-3]。酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）最初表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化，甚至誘發(fā)肝細(xì)胞壞死及肝功能衰竭[3-5]。酒精在肝臟中的代謝過程為：乙醇在肝微粒體氧化酶系統(tǒng)中經(jīng)乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙醛，而乙醛在P450酶系統(tǒng)中經(jīng)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，最終生成水和二氧化碳[6-8]，但該代謝過程中的中間產(chǎn)物將直接危害肝臟的健康，導(dǎo)致肝臟乙醛中毒、酸中毒等[9]。據(jù)報(bào)道，在全球范圍內(nèi)，ALD的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，酒精已成為僅次于肝炎病毒導(dǎo)致肝損傷的重要病因之一[10]。在臨床醫(yī)學(xué)上常采用美他多辛、聯(lián)苯雙酯滴丸、水飛薊素類、多烯磷脂酰膽堿等藥物治療ALD[11]，但藥物治療對(duì)于晚期ALD并沒有效果，且藥物治療對(duì)人體本身也有一定的傷害。因此，尋找天然高效的保肝產(chǎn)品已成為當(dāng)今食品及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域共同的研究熱點(diǎn)。

石榴（Punica granatum L.）葉中含有多種有效成分，賦予了石榴葉多種生理功能，如收斂止瀉、軟化血管、抗菌、抗病毒、美容、降低血脂水平、抗腫瘤、抗突變、抗氧化等[12-15]。在國(guó)外，石榴葉已作為一種理想的藥食資源[16]，而在國(guó)內(nèi)，石榴葉則多被廢棄，造成資源的浪費(fèi)。目前對(duì)石榴葉的研究多側(cè)重于對(duì)其提取、純化，以及探索其在抗氧化、消炎等方面的作用[17-19]，尚未見石榴葉多酚對(duì)ALD的預(yù)防及保健作用的報(bào)道。本研究擬采用石榴葉為原材料，探究石榴葉多酚對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，以期為尋找預(yù)防和治療ALD的有效方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

石榴葉（Punica granatum L. leaves）采于南京市鼓樓區(qū)，經(jīng)洗凈烘干后，用粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩，避光保存?zhèn)溆?。取粉?0 g，加入40%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH值為2，置超聲破碎器下進(jìn)行破碎，60 ℃水浴1.5 h ，4 500 r/min離心10 min后過濾，濾渣再提取一次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸餾得到濃縮液，冷凍干燥即得石榴葉粗多酚（crude polyphenols from Punica granatum L. leaves，CPPL），經(jīng)AB-8樹脂的分離純化，冷凍干燥即得石榴葉多酚1（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 1，PPPL1），再過聚酰胺層析柱，冷凍干燥即得石榴葉多酚2（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 2，PPPL2）。

AB-8樹脂、聚酰胺樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.1.2 動(dòng)物

6 周齡雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（27±2） g，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0047。

1.1.3 試劑

酒精 南京創(chuàng)化化玻儀器有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江醫(yī)藥有限公司新昌制藥廠；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、醋酸鈾、檸檬酸鉛南京建成生物工程研究所；戊二醛、無水乙醇和丙酮等南京榮世德有限公司；四氧化鋨酸、中性樹脂 美國(guó)Sigma公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎器 寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；722可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；H-7650日立透射電鏡 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性酒精性肝損傷模型建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將小鼠隨機(jī)分為6 組：空白組，模型組，PPPL2低、中、高劑量組（100、200、400 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計(jì)，下同）），陽性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯滴丸，150 mg/（kg·d）），每組10 只。空白組與模型組小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的去離子水；PPPL2各劑量組小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的PPPL2樣品（PPPL2樣品用去離子水配制）；陽性對(duì)照組小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的聯(lián)苯雙酯滴丸1次（藥品用去離子水配制）。6 組小鼠連續(xù)灌胃30 d，期間供給全價(jià)顆粒飼料，不限制飼料及水。實(shí)驗(yàn)到31 d ，對(duì)各組小鼠禁食12 h但不禁水，之后除空白組外，其余組小鼠均灌胃50%酒精（12 mL/kg），建立急性酒精性肝損傷模型[20]。

1.2.2 樣品制備

血清：取小鼠眼球血靜置2 h后，3 500 r/min離心10 min，小心吸取血清。

肝勻漿：準(zhǔn)確稱取0.1 g肝組織，清洗、拭干、剁碎，加0.9 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），超聲破碎，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝勻漿。

肝組織切片（電鏡觀察樣品）：將迅速選出的肝左葉中部切成1 mm3左右的塊狀，置于體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛中固定。

1.2.3 AST、ALT、TG水平測(cè)定

嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法操作，測(cè)定AST、ALT、TG水平。

1.2.4 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察

樣品先用PBS清洗，再置于四氧化鋨酸中固定2 h，用0.1 mol/L PBS清洗，丙酮梯度脫水，丙酮及樹脂混合液浸透1 h，純樹脂浸透2 h。隨后，對(duì)樣品進(jìn)行包埋，在聚合爐中聚合24 h，修塊、定位，用鉆石刀切成超薄切片附到銅網(wǎng)后，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，瀝干，用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照[21]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 13.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPPL2對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟中AST、ALT活力的影響

表1 PPPL2對(duì)小鼠肝臟中AST、ALT活力的影響（x±s，n＝10）Table 1 Effect of PPPL2 on AST and ALT levels in liver of mice (x±s,n= 10)

由表1可知，模型組小鼠肝臟中AST、ALT活力顯著高于空白組（P＜0.05或P＜0.01），提示小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功。與模型組相比，PPPL2各劑量組小鼠肝臟中AST、ALT活力隨著PPPL2劑量的增加逐漸降低，其中PPPL2高劑量組小鼠肝臟中ALT活力已達(dá)到陽性對(duì)照組水平，較模型組降低了10.62%；PPPL2高劑量組小鼠肝臟中AST活力較模型組降低了22.88%。以上結(jié)果提示PPPL2可有效降低小鼠急性酒精性肝損傷肝組織中AST、ALT活力，表明PPPL2對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

2.2 PPPL2對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠血清TG含量和AST、ALT活力的影響

表2 PPPL2對(duì)小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力的影響（x±s，n＝10）Table 2 Effect of PPPL2 on TG, AST and ALT levels in serum of mice (x±s,n= 10)

由表2可知，模型組小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力較空白組分別增長(zhǎng)了46.67%、145.26%、23.2%，其中TG含量和AST活力與空白組的差異達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。與模型組相比，PPPL2各劑量組小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力隨著PPPL2劑量的增加逐漸降低，PPPL2高劑量組小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力分別較模型組降低了22.7%、34.57%、14.65%，其中PPPL2高劑量組小鼠血清中TG含量和ALT活力已達(dá)到陽性對(duì)照組水平，而AST活力甚至比陽性對(duì)照組更低。以上結(jié)果提示PPPL2可有效降低急性酒精性肝損傷引起的小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力的升高，表明PPPL2對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

2.3 小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)分析

透射電鏡下觀察石榴葉多酚2對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各組小鼠肝組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of mouse liver tissue in each group

如圖1A所示，空白組小鼠肝組織的細(xì)胞核大且圓，核膜清晰無損壞，核內(nèi)清晰可見核仁，線粒體形狀規(guī)則且豐富，線粒體嵴清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整齊排列，可見豐富的核糖體顆粒在其上分布，染色質(zhì)平均分布在核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)豐富，無核糖體脫落及脂質(zhì)化現(xiàn)象。

如圖1B所示，模型組小鼠肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞內(nèi)可見較多脂滴，整體細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)雜亂，染色質(zhì)分布異常，核膜皺縮，線粒體呈桿狀，線粒體雙側(cè)膜及嵴模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雜亂并有擴(kuò)張腫脹現(xiàn)象，核糖體顆粒減少并脫落。

如圖1C所示，PPPL2低劑量組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在較多的脂滴但較模型組少，核膜呈不規(guī)則鋸齒狀，線粒體形狀較模型組規(guī)則，線粒體膜及嵴均不清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹，排列散亂，核糖體脫落明顯，整體較模型組有減輕的趨勢(shì)。

如圖1D所示，PPPL2中劑量組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)明顯可見脂滴，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，局部明顯內(nèi)陷或者凸出，線粒體較模型組增多，大多呈圓形或橢圓狀，線粒體周圍粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，并有明顯的核糖體脫落現(xiàn)象。

如圖1E所示，PPPL2高劑量組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)偶見少許脂滴，核膜完整呈圓形，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，線粒體數(shù)量較模型組更多且形狀更規(guī)則，線粒體嵴及雙層膜清晰可見，正體接近空白組，在視野內(nèi)未見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹現(xiàn)象。

如圖1F所示，陽性對(duì)照組小鼠肝組織的細(xì)胞核呈不規(guī)則形態(tài)，但核膜完整，線粒體豐富度與空白組相差不多，線粒體嵴清晰，外膜呈圓形或橢圓形，無不規(guī)則線粒體，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，視野內(nèi)未見脂滴。

3 討 論

ALD包括一系列肝臟的損傷，從單純性脂肪肝可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。酒精已被認(rèn)為是導(dǎo)致ALD的主要因素[22]，酒精代謝將導(dǎo)致肝細(xì)胞的氧化還原處于失衡狀態(tài)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）出現(xiàn)異常比率、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)及線粒體功能發(fā)生障礙等一系列非正常生理狀態(tài)[23-24]。

肝臟是含有線粒體最豐富的器官之一，每個(gè)肝細(xì)胞中約有800 個(gè)線粒體，其具有重要的生理功能，如：為細(xì)胞提供能量，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程[25]，但當(dāng)機(jī)體攝入大量的酒精，乙醇在肝臟中的代謝會(huì)直接破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致線粒體功能的變化甚至喪失，并使存在于細(xì)胞漿和線粒體中的AST及ALT釋放入血液，引起血清中ALT和AST活力的升高[26]。肝細(xì)胞中還普遍存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有合成并轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、脂類的功能，同時(shí)還具有有效清除脂溶性代謝廢物及有害物質(zhì)等功能，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工運(yùn)輸發(fā)生障礙及生理功能發(fā)生紊亂的一系列病理過程，研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也參與了肝損傷的過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能一旦發(fā)生紊亂，脂蛋白的合成將會(huì)受到抑制，而TG的合成功能正常時(shí)，導(dǎo)致脂肪不能順利運(yùn)輸出細(xì)胞，脂肪在肝細(xì)胞中逐漸堆積，最終出現(xiàn)脂滴[27]。另外，乙醇的中間代謝產(chǎn)物會(huì)破壞三羧酸循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，使得脂肪酸的氧化受到阻礙，磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)變?yōu)棣?磷酸甘油，而α-磷酸甘油與脂肪酸作用后合成的TG沉積在肝細(xì)胞內(nèi)，也將導(dǎo)致肝細(xì)胞中出現(xiàn)脂滴[28]。

臨床上通過測(cè)定ALT、AST活力和TG水平作為判斷肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一[29]，因此通過研究TG含量和ALT、AST活力，可以推斷出小鼠肝臟的健康狀況。本實(shí)驗(yàn)造模后發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟AST、ALT活力及血清中TG含量和ALT、AST活力均有明顯升高，提示小鼠急性肝損傷模型建立成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPPL2對(duì)酒精所致的小鼠肝臟AST、ALT活力的升高及血清中TG含量和ALT、AST活力的升高均有所改善，尤其是PPPL2高劑量組的改善作用更加明顯。表明PPPL2可改善因酒精引起的TG含量和ALT AST活力升高現(xiàn)象，說明PPPL2可有效提高肝臟的酒精代謝能力，阻止脂肪在肝細(xì)胞中的沉積，對(duì)ALD有一定的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察小鼠肝組織的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：造模成功后，小鼠肝細(xì)胞中線粒體變形，呈不規(guī)則的畸形狀態(tài)，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、核糖體顆粒脫落等現(xiàn)象明顯；而隨著PPPL2劑量的增加，PPPL2各劑量組小鼠肝細(xì)胞的線粒體逐漸呈現(xiàn)規(guī)則狀，其中PPPL2高劑量組小鼠肝細(xì)胞的線粒體形態(tài)與空白組無明顯差異，脂滴也隨著PPPL2劑量的增加而減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病癥則相應(yīng)得到改善，這些結(jié)果提示PPPL2對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。該保護(hù)作用機(jī)理可能與石榴葉多酚的抗氧化活性有關(guān)，PPPL2的抗氧化作用可能是通過提高清除自由基的酶的活性，抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，從而減輕酒精對(duì)小鼠肝臟的損傷。

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Protective Effect of Polyphenols from Punica granatum L. Leaves against Alcohol-Induced Acute Hepatic Injury in Mice

XING Jia, LU Wenjuan, ZHAO Yunxia, TAO Mingxuan*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Objective: To investigate the protective effect of purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 2 (PPPL2) on acute alcoholic hepatic injury in mice. Methods: Totally 60 mice were randomly divided into control group, model group, low-, middle- and high-dose PPPL2 groups, and positive control group (bifendate, 150 mg/(kg·d)) of 10 mice each. The mice from the control and model groups were administrated with deionized water (0.1 mL/(10 g·d)) daily by gavage for 30 consecutive days. The mice from three different dose groups were administrated with PPPL2 at 100, 200 and 400 mg/(kg·d)), respectively. The mice from the positive control group were administrated with bifendate (150 mg/(kg·d)). The model of acute alcoholic liver injury was established on the 31stday, and all mice were gavaged with 50% alcohol (12 mL/kg), except for the control group. Biochemical indicators of ocular blood in mice were observed. Results: Compared with the model group, the levels of glutamic-oxaloacetic transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), and triglyceride (TG) were obviously decreased in the treatment groups, and the mice from these treatment groups had reduced expansion of mitochondria and glycogen deposition. In addition, the endoplasmic reticulum was not obviously outspread and lipid droplets were reduced in hepatic cells. Conclusion: Polyphenols from pomegranate leaves have protective effect on alcoholic hepatic injury.

polyphenols from pomegranate leaves; acute alcoholic hepatic injury; biochemical indicators; ultrastructure

TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0253-05

10.7506/spkx1002-6630-201521047

2014-12-23

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYLX_0729）

邢佳（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)與保健功能因子。E-mail：Christina_320@yeah.net

*通信作者：陶明煊（1970—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)與保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn