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        兩步超濾法分離甘薯β-淀粉酶

        2015-12-26 09:43:48梁新紅孫俊良馬漢軍王田林
        食品科學(xué) 2015年21期
        關(guān)鍵詞:超濾膜甘薯淀粉酶

        梁新紅,孫俊良,馬漢軍,王田林

        (河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

        兩步超濾法分離甘薯β-淀粉酶

        梁新紅,孫俊良*,馬漢軍,王田林

        (河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

        采用50 kD和10 kD兩種超濾膜對(duì)甘薯β-淀粉酶進(jìn)行兩步超濾,研究了超濾分離甘薯中β-淀粉酶的最佳工藝。結(jié)果表明,膜超濾中跨膜壓力為0.12 MPa、超濾時(shí)間40 min、操作溫度35 ℃、物料pH值為7.0。在此條件下,β-淀粉酶比活力為71 627 U/mg,純化倍數(shù)為11.85,酶活回收率為82.79%,表明分離后的酶經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析為單一條帶。

        兩步超濾法;分離純化;甘薯;β-淀粉酶

        β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是外切型糖化酶,作用于淀粉的水解產(chǎn)物是麥芽糖及大分子β-界限糊精,主要應(yīng)用于食品、發(fā)酵、紡織、制藥等工業(yè)過程中[1-5]。β-淀粉酶廣泛存在于高等植物中,如甘薯、大麥、小麥、大豆等[6-9]。甘薯中β-淀粉酶是塊根中僅次于甘薯貯藏蛋白的一種蛋白質(zhì)成分,約占?jí)K根可溶性蛋白的5%[10-11]。與微生物β-淀粉酶相比,植物中的β-淀粉酶具有酶活力高、耐熱性好、作用pH值范圍廣等特點(diǎn)[12-13]。隨著淀粉行業(yè)的迅猛發(fā)展,β-淀粉酶的應(yīng)用范圍越來越廣,而我國β-淀粉酶的研制并沒有取得大的突破。

        β-淀粉酶純化一般先用硫酸銨沉淀獲得粗酶液,然后用凝膠柱如Sephadex G-200[14-15],離子交換柱如DEAECellulofine[14,16]、DEAE-Sephrose[17]等,以及FPLC MonoQ柱層析技術(shù)[18]進(jìn)行層析分離,這些分離方法雖然產(chǎn)品純度高,但分離規(guī)模有限且酶活回收率較低。

        超濾是以大分子與小分子分離為目的,以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一[19]。超濾法以膜的截留分子質(zhì)量對(duì)物料進(jìn)行分離[20-21]。超濾應(yīng)用于蛋白的分離純化已有報(bào)道,Datta等[22]應(yīng)用兩步超濾法分離純化蛋清中卵清蛋白,郝更新等[23]應(yīng)用超濾法富集了牡蠣蛋白活性肽,Zhou等[24]應(yīng)用超濾法分離純化了玉米蛋白的抗氧化活性肽。未見有應(yīng)用兩步超濾法分離純化甘薯β-淀粉酶的文獻(xiàn)報(bào)道。

        本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同孔徑的中空纖維超濾膜,研究?jī)刹匠瑸V分離純化甘薯中β-淀粉酶,并研究超濾時(shí)跨膜壓力、超濾時(shí)間、溫度及酶液pH值等對(duì)膜通量的影響,優(yōu)化兩步超濾工藝參數(shù),為甘薯β-淀粉酶高效分離提供實(shí)踐及理論基礎(chǔ),以期為β-淀粉酶工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        甘薯:徐薯18號(hào),采自河南科技學(xué)院甘薯實(shí)驗(yàn)田。

        1.2 儀器與設(shè)備

        膜超濾分離裝置(中空纖維超濾膜(孔徑分別為50、10 kD)) 上海亞東核級(jí)樹脂有限公司;RC5C型冷凍離心機(jī) 美國Sovall公司。

        1.3 方法

        1.3.1 甘薯β-淀粉酶粗酶液制備

        稱取1 000 g甘薯,洗凈后切塊,加入蒸餾水2 000 mL,于粉碎機(jī)中粉碎1 min。過40 目篩,濾液置于冷凍離心機(jī)中4 ℃、4 000 r/min離心15 min。取上清液于4 ℃冰箱中保存。

        稱取硫酸銨472 g,上清液1 000 mL,調(diào)至硫酸銨的飽和度為70%,用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值至5.0,于4 ℃冰箱中靜置4 h。然后用冷凍離心機(jī)4 ℃、8 000 r/min離心15 min,收集沉淀。將沉淀溶解至500 mL,選用截留分子質(zhì)量為10 kD的透析袋透析除鹽24 h。

        1.3.2 膜通量的測(cè)定

        膜通量即單位時(shí)間內(nèi)通過單位膜面積的透過液體積。超濾系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后,控制壓力、溫度、pH值等操作參數(shù),待運(yùn)行穩(wěn)定后取樣,記錄一定時(shí)間內(nèi)的透過液體積,膜通量計(jì)算見下式。

        式中:J為膜通量/(L/(m2·h));V為透過液總體積/L;t為過濾時(shí)間/h;A為有效膜面積/m2。

        1.3.3 超濾操作

        第1步:粗酶液經(jīng)50 kD膜超濾,主要截留粗酶液中大分子蛋白及其他大分子有機(jī)物,甘薯β-淀粉酶分子質(zhì)量小于50 kD[25-26],進(jìn)入透過液中,進(jìn)行第2步超濾。

        第2步:用10 kD膜超濾,主要將第1步透過液中低分子蛋白及其他小分子物質(zhì)與β-淀粉酶分離,同時(shí)將β-淀粉酶濃縮。β-淀粉酶被截留,冷凍干燥后獲得純化的β-淀粉酶。

        1.3.4 超濾工藝參數(shù)對(duì)膜通量的影響

        將透析除鹽過后的樣液進(jìn)行抽濾。抽濾過后,取濾液1 000 mL置于燒杯中待用。連接好超濾裝置,提取100 mL濾液與燒杯中加水稀釋至500 mL。經(jīng)離心泵壓入膜組件,透過液經(jīng)膜外側(cè)流出,用刻度量筒收集,截留液經(jīng)膜內(nèi)側(cè)流回?zé)小U{(diào)節(jié)壓力旋鈕分別記錄在壓力為0.02~0.16 MPa、溫度20~40 ℃、pH 4~8、時(shí)間5~60 min時(shí)的不同透過液體積,計(jì)算膜通量。

        1.4 分析方法

        1.4.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

        采用Folin-酚法[27]測(cè)定。

        1.4.2 β-淀粉酶活力的測(cè)定

        采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[28]測(cè)定β-淀粉酶活力。酶活力單位定義為:在60 ℃、pH 5.6條件下,每小時(shí)從1.1%的可溶性淀粉溶液中釋放出1 mg麥芽糖的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位(U)。

        1.4.3 β-淀粉酶的純化

        采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)[28]測(cè)定。

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        采用DPS 7.55數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差顯著性進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 跨膜壓力對(duì)超濾膜通量的影響

        在粗酶液pH 6.0、溫度35 ℃條件下,對(duì)粗酶液進(jìn)行兩步超濾,兩步超濾時(shí)間均為40 min,考察操作壓力為0.02~0.14 MPa時(shí)對(duì)膜通量的影響,結(jié)果見圖1。

        n=3)Fig.1 Effect of transmembrane pressure on ultrafiltration efficiency (n = 3)圖1跨膜壓力對(duì)膜超濾效果的影響(

        由圖1可知,隨著操作壓力的增加,50 kD和10 kD兩種膜的膜通量均隨著操作壓力的升高而逐漸增加。在操作壓力由0.02 MPa升至0.12 MPa時(shí),50 kD膜的膜通量達(dá)到最高值,為(8.12±0.22)L/(m2·h),隨著壓力繼續(xù)升至0.14 MPa,膜通量沒有顯著增加。經(jīng)方差顯著性分析,操作壓力為0.12 MPa和0.14 MPa時(shí),膜通量沒有顯著性差異(P<0.05)。而截留分子質(zhì)量為10 kD的膜隨著操作壓力由0.02 MPa升至0.14 MPa,膜通量逐漸升高,最高為(22.96±0.95)L/(m2·h)。這是因?yàn)樵诖置敢哼M(jìn)行超濾時(shí),壓力引起的溶質(zhì)集聚速率小于料液切向流帶走的溶質(zhì)速率,在一定壓差范圍內(nèi),膜通量隨著壓力差的增加而增加;50 kD膜在壓力達(dá)到0.12 MPa之后,吸附和凝膠層迅速形成并且增大,這時(shí)增大壓力產(chǎn)生的壓差會(huì)很快被加厚和壓實(shí)的凝膠層所抵消,故在壓力達(dá)到0.12 MPa后即使再升高,通量不再隨著壓力的增大而增大,這時(shí)的壓力稱為臨界壓力。10 kD膜隨著操作壓力升高,膜通量有升高趨勢(shì),但壓力過大會(huì)將一些與膜孔大小相近的分子壓進(jìn)膜孔,增加膜污染危險(xiǎn),反而會(huì)使通量降低,更加嚴(yán)重的還會(huì)將膜壓實(shí),造成膜不可逆的損壞。因此,超濾膜組件的操作壓力選擇為0.12 MPa。

        2.2 操作時(shí)間對(duì)超濾膜通量的影響

        在粗酶液pH 6.0、溫度35 ℃、超濾壓力0.12 MPa條件下,對(duì)粗酶液進(jìn)行兩步超濾,考察操作時(shí)間5~60 min時(shí)對(duì)膜通量的影響,結(jié)果見圖2。

        n=3)Fig.2 Effect of operating time on ultrafiltration efficiency (n = 3)圖2操作時(shí)間對(duì)膜超濾效果的影響(

        由圖2可知,50 kD和10 kD膜的膜通量隨時(shí)間的變化均可分為3 個(gè)階段。

        第1階段:5~15 min內(nèi),膜通量迅速下降階段。50 kD膜的膜通量由(11.63±0.51) L/(m2·h)迅速下降至(8.33±0.35) L/(m2·h)。10 kD膜的膜通量由(27.67±0.99) L/(m2·h)迅速下降至(21.73±0.90) L/(m2·h)。在此階段內(nèi)膜通量的迅速下降主要是由于物料中的溶質(zhì)和膜接觸的過程中,迅速產(chǎn)生了濃差極化、膜孔堵塞、凝膠層、膜吸附等一系列的現(xiàn)象,而這些現(xiàn)象的產(chǎn)生都容易增加透過的阻力,導(dǎo)致通量迅速下降。

        第2階段:15~40 min內(nèi),膜通量值的變化趨于平穩(wěn)。50 kD膜的膜通量由(8.33±0.35)L/(m2·h)降至(8.12±0.32) L/(m2·h)。10 kD膜的膜通量由(21.73±0.90)L/(m2·h)降至(21.59±0.88)L/(m2·h)。在15~40 min內(nèi)膜通量緩慢下降,趨于平穩(wěn),主要由于在超濾的過程中不斷加入比較稀的物料,使得濃縮物料又恢復(fù)到原來的濃度,所以在物料的濃度變化不大,壓力保持不變的情況下,濃差極化、膜孔堵塞、凝膠層、膜吸附增加的幅度很小,透過阻力增加很小,膜通量也下降很慢。

        第3階段:40~60 min,膜通量又呈迅速下降趨勢(shì)。50 kD膜的膜通量由(8.12±0.32)L/(m2·h)降至(3.59±0.15)L/(m2·h),10 kD膜的膜通量由(21.59±0.88)L/(m2·h)降至(9.41±0.37)L/(m2·h)。這主要是優(yōu)于隨著超濾的進(jìn)行,超濾膜的膜孔被堵塞以及蛋白質(zhì)濃度極差化的形成。

        因此,中空纖維膜在對(duì)甘薯β-淀粉酶進(jìn)行超濾濃縮時(shí),超濾時(shí)間應(yīng)控制在40 min,然后對(duì)膜進(jìn)行清洗,恢復(fù)通量后再使用。

        2.3 操作溫度對(duì)超濾膜通量的影響

        在粗酶液pH 6.0、超濾時(shí)間40 min、超濾壓力0.12 MPa條件下,對(duì)粗酶液進(jìn)行兩步超濾,考察操作溫度20~40 ℃時(shí)對(duì)膜通量的影響,結(jié)果見圖3。

        n=3)Fig.3 Effect of operating temperature on ultrafiltration efficiency (n = 3)圖3操作溫度對(duì)膜超濾效果的影響(

        由圖3可知,隨著操作溫度的提高,膜通量逐漸增加,并且通過數(shù)據(jù)分析,膜通量和溫度成線性關(guān)系。50 kD膜的線性方程為y=0.193x+7.365(R2=0.997 5),10 kD膜的線性方程為y=0.774x+18.338(R2=0.982 2)。因此,在一定溫度范圍內(nèi),膜通量隨著溫度的升高而增加。這可能是由于隨著操作溫度的升高,酶的擴(kuò)散系數(shù)增加,黏度減小。且在一定的壓力下,隨著溫度的增加,物料沿凝膠層表面的切線流速有所增加,凝膠層中由界面向液相主體的反向擴(kuò)散也會(huì)增加,濃差極化影響隨之減小,使酶的透過阻力減小,膜通量就會(huì)提高。

        雖然增加粗酶液的操作溫度可以提高膜通量,但是在選擇操作溫度時(shí)還需要考慮膜的耐受能力和物料對(duì)溫度的敏感性。由于本實(shí)驗(yàn)采用的中空纖維超濾膜的最高耐受溫度為40 ℃,并且不適合在40 ℃左右長期操作,而且β-淀粉酶具有生物活性,在高溫下長時(shí)間操作會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失,因此,中空纖維膜組件的操作溫度選擇35 ℃。

        2.4 粗酶液pH值對(duì)超濾膜通量的影響

        β-淀粉酶作用pH值范圍為4.0~7.0,在粗酶液的超濾時(shí)間40 min、超濾壓力0.12 MPa、溫度35 ℃條件下對(duì)粗酶液進(jìn)行兩步超濾,考察粗酶液pH 4.0~7.0時(shí)對(duì)膜通量的影響,結(jié)果見圖4。

        n=3)Fig.4 Effect of crude enzyme solution pH on ultrafiltration efficiency (n = 3)圖4粗酶液pH值對(duì)膜超濾效果的影響(

        由圖4可知,粗酶液pH值為4.0和6.0~7.0時(shí),50 kD超濾膜和10 kD超濾膜的膜通量均高于pH 5.0。50 kD和10 kD超濾膜在粗酶液pH 5.0時(shí),膜通量均最低,分別為(3.96±0.09) L/(m2·h)和(13.28±0.65) L/(m2·h);在粗酶液pH 7.0時(shí),膜通量最高,分別為(9.03±0.31) L/(m2·h)和(22.73±0.90) L/(m2·h)。這是因?yàn)榇置敢旱膒H值會(huì)影響膜表面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。甘薯β-淀粉酶等電點(diǎn)為pH 5.0左右[29],當(dāng)溶液pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)靜電斥力增加,溶解度增大,不容易被膜表面吸附;而當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)靜電斥力最小,相應(yīng)溶解度降低,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在膜表面的吸附力增加,并在膜表面形成吸附層,使膜污染增加,傳質(zhì)阻力增大,導(dǎo)致膜通量降低。因此應(yīng)用50 kD和10 kD超濾膜時(shí),選擇物料pH值為7.0。

        2.5 兩步超濾法對(duì)β-淀粉酶純化效果

        兩步超濾法具有純化和濃縮的作用,運(yùn)用截留分子質(zhì)量的不同對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行截留,從而達(dá)到純化的目的;其次,將酶液中的中、低分子質(zhì)量蛋白及其他小分子物質(zhì)與β-淀粉酶分離,從而進(jìn)行濃縮。在超濾膜組件的跨膜壓力為0.12 MPa、超濾時(shí)間40 min、操作溫度35 ℃、物料pH值為7.0條件下,研究選用截留分子質(zhì)量為50 kD和10 kD的中空纖維膜,以酶比活力及提純倍數(shù)等為指標(biāo)對(duì)β-淀粉酶進(jìn)行兩步超濾法純化,結(jié)果見表1。β-淀粉酶比活力提高至71 627 U/mg,純化倍數(shù)為11.85,酶活回收率為82.79%。對(duì)兩步超濾純化后的β-淀粉酶進(jìn)行SDS-PAGE分析,檢驗(yàn)其純度,電泳圖譜如圖5。

        表1 兩步超濾法對(duì)β-淀粉酶純化效果Table 1 Purification ofβ-amylase using two-stage ultrafiltration technique

        由圖5可知,經(jīng)兩步超濾后,甘薯β-淀粉經(jīng)SDS-PAGE分析為單一條帶,表明經(jīng)兩步超濾法β-淀粉酶分離純化效果較理想,研究結(jié)果與Teotia等[26]相近。

        -淀粉酶SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of β-amylase from sweet potato after ultrafiltration圖5超濾后甘薯β

        3 結(jié) 論

        兩步超濾分離純化技術(shù)操作簡(jiǎn)便,不需添加任何化學(xué)試劑,尤其是超濾技術(shù)實(shí)施條件溫和,而且不引起溫度、pH值的變化,因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。用于β-淀粉酶的分離與純化,具有耗用化學(xué)試劑少,操作簡(jiǎn)單,成本低,易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),具有較大的推廣價(jià)值。采用超濾技術(shù)分離純化甘薯β-淀粉酶,最佳操作條件為跨膜壓力為0.12 MPa、超濾時(shí)間40 min、操作溫度35 ℃、物料pH值為7.0。在此條件下,β-淀粉酶比活力為71 627 U/mg,純化倍數(shù)為11.85,酶活回收率為82.79%,酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳為單一條帶。研究表明,采用兩步超濾法分離純化甘薯β-淀粉酶效果較佳。研究將為甘薯β-淀粉酶工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

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        Separation of β-Amylase from Sweet Potato Using Two-Stage Ultrafiltration Technique

        LIANG Xinhong, SUN Junliang*, MA Hanjun, WANG Tianlin
        (School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

        The separation of β-amylase from sweet potato using ultrafiltration was investigated. A two-stage ultrafiltration scheme employing 50 and 10 kD membranes was used for accomplishing the desired separation. The results showed that β-amylase with high purity could be obtained by the proposed separation technique transmembrane pressure of 0.12 MPa, ultrafiltration time of 40 min, ultrafiltration temperature of 35 ℃ and crude enzyme solution pH of 7.0. Under these conditions, the specific activity of β-amylase was 71 627 U/mg, with a purification fold of 11.85 and a recovery yield of 82.79%. The high purity of β-amylase was also reflected by the single band on SDS-PAGE.

        two-stage ultrafiltration technique; separation; sweet potato; β-amylase

        TS209;TQ925.1

        A

        1002-6630(2015)21-0180-05

        10.7506/spkx1002-6630-201521034

        2015-05-10

        河南省教育廳自然科學(xué)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目(14A550010);河南省高??萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(13IRTSTHN006);

        國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目

        梁新紅(1971—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:liangxinhong2005@163.com

        *通信作者:孫俊良(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:sjl338@163.com

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