徐嘉良，杜小莉，盧 昕,*

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

全球副溶血弧菌環(huán)境菌株的基于堿基序列和肽鏈序列的多位點(diǎn)序列分型

徐嘉良1，杜小莉2，盧 昕2,*

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

為了了解來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株的群組結(jié)構(gòu)和克隆復(fù)合體構(gòu)成，利用PubMLST公共數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)，篩選其中具有完整序列分型（sequence type，ST）及肽序列型（peptide sequence type，pST）的來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株數(shù)據(jù)，進(jìn)行亞群分析和克隆復(fù)合體分析，并分別構(gòu)建了基于ST型和pST型的最小生成樹(shù)。結(jié)果表明，從數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到具有ST型及pST型的來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株數(shù)據(jù)886 條，共含有663 個(gè)ST型，以ST3型為最多，但也僅含27 條菌株信息。其中，有436 條菌株數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)（包括大陸、香港和臺(tái)灣），覆蓋了410 個(gè)ST型，每個(gè)ST型含1～4 條菌株數(shù)據(jù)，這436 條菌株數(shù)據(jù)又可分為128 個(gè)pST型，其中pST1型為最多，達(dá)116 條菌株數(shù)據(jù)。利用eBURST軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了73 個(gè)組，483 個(gè)單體。STRUCTURE軟件分析顯示來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株的適宜亞群數(shù)為4，各亞群內(nèi)的樣品平均距離為0.981 7。綜上結(jié)果表明，來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株具有高度多態(tài)性，可更細(xì)分為4 個(gè)亞群，MLST分型時(shí)以ST3型為多，AA-MLST分型時(shí)以pST1型為主。

副溶血弧菌；基于堿基序列的多位點(diǎn)序列分型；基于肽鏈的多位點(diǎn)序列分型；克隆復(fù)合體

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）屬于弧菌科弧菌屬，菌體呈弧狀、桿狀等形態(tài)，革蘭染色呈陰性。1950年，F(xiàn)ujino在日本的一次食物中毒中首次發(fā)現(xiàn)并成功分離培養(yǎng)到副溶血弧菌[1]。食用含有副溶血弧菌的食物可能引發(fā)食源性胃腸道炎癥，少數(shù)情況下還可引發(fā)敗血癥，危及患者生命。該菌主要來(lái)自于海產(chǎn)品，常見(jiàn)者為蟹類、烏賊、海蜇、魚、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬菜，已在全球頻繁引起食物中毒事件[2]。從遺傳角度和血清型角度看，副溶血弧菌都存在高度多態(tài)性。目前，副溶血弧菌包括13 種不同的O抗原和71 個(gè)不同的K抗原[3-4]，但與霍亂弧菌（Vibrio cholera）不同，目前的研究顯示副溶血弧菌的致病性并不與特定的血清型相關(guān)，目前有71 種血清型的副溶血弧菌均可以引起胃腸炎[5]。自1996年起，副溶血弧菌在全球地區(qū)開(kāi)始暴發(fā)，其中以O(shè)3:K6血清型的副溶血弧菌為主要的暴發(fā)菌株。之后，開(kāi)始在全球迅速傳播。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，一些分子分型技術(shù)，如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[6]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA片段（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[7]、核糖體基因分型[8]、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）[9]、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[10]和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multilocus variable number tandem repeat analysis，MLVA）[11]等，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定、分型溯源、種群結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化分析及分子流行病學(xué)[12-13]的調(diào)查和食品安全溯源等方面研究[14]。MLST方法因其豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)可研究不同地域不同來(lái)源的菌株遺傳變異情況，已被用于區(qū)分副溶血弧菌[15]。副溶血弧菌的MLST在2008年由González-Escalona等[16]提出，由7 個(gè)基因片段獲得菌株的序列分型（sequence type，ST）。隨后2014年，Urmersbach等[17]在副溶血弧菌的群體結(jié)構(gòu)分析中又提出了基于肽鏈序列的多位點(diǎn)分型（amino acid multilocus sequence typing，AA-MLST）方案。由于副溶血弧菌遺傳上的多態(tài)性，尤其是環(huán)境菌株呈現(xiàn)出高度多態(tài)性，因此應(yīng)用AA-MLST進(jìn)行菌株遺傳關(guān)系研究可能會(huì)得到更為可信的結(jié)果[17]。本研究將采用MLST方案和AA-MLST方案分別研究來(lái)自PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的來(lái)自全球地區(qū)的副溶血弧菌環(huán)境菌株的群體結(jié)構(gòu)，為我國(guó)副溶血弧菌的預(yù)防控制提供參考，通過(guò)采取針對(duì)性的手段，減少致病性的環(huán)境菌株對(duì)食品的污染，為保障我國(guó)的食品安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)

全部數(shù)據(jù)均來(lái)自于截止到2015年2月10日之前的PubMLST公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubmlst.org/ vparahaemolyticus/），共有來(lái)自于全球副溶血弧菌的1 689 條數(shù)據(jù)，其中包括臨床菌株（分離自病人）和環(huán)境菌株（分離自外環(huán)境水體和水產(chǎn)品中）。篩選其中的環(huán)境菌株，且具備ST型信息及肽序列型（peptide suquence type，pST）的數(shù)據(jù)條目，共篩選出886 條，用于后續(xù)分析。

1.2 克隆群結(jié)構(gòu)分析

采用eBURST version 3（http://eburst/mlst.net）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行克隆復(fù)合體的分析，分析中采用了1 000次Bootstrap重排。本研究中，限定7 個(gè)管家基因中必須有6 個(gè)及以上相同的歸為同分型組，若該組中含4 個(gè)及以上的ST型，該組即為一個(gè)克隆復(fù)合體（clonal complex，CC），并確定其中一個(gè)ST型在進(jìn)化關(guān)系上可能是祖先ST型，定為起源。不屬于任何1 個(gè)克隆復(fù)合體的ST型被稱為單體。

1.3 STRUCTURE軟件分群

應(yīng)用STRUCTURE2.3.4軟件，計(jì)算來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株歸屬第k亞群的概率Q值。在確定亞群數(shù)時(shí)，選擇獨(dú)立等位基因頻率模型，依次設(shè)定亞群數(shù)目K為1～11，將馬爾科夫鏈蒙特卡洛（Markov chain Monte Carlo，MCMC）迭代設(shè)為110 000 次，去掉前10 000 次，每個(gè)K重復(fù)獨(dú)立運(yùn)行4 次。

1.4 Bionumerics分析

采用Bionumerics軟件分別對(duì)MLST數(shù)據(jù)及AA-MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建最小生成樹(shù)，以菌株來(lái)源國(guó)家或菌株來(lái)源地區(qū)（亞洲、拉丁美洲、歐洲、美洲）為顏色區(qū)分，圓圈大小代表菌株數(shù)量，研究不同國(guó)家來(lái)源菌株群體結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化關(guān)系，比較MLST方案及AA-MLST方案對(duì)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLST數(shù)據(jù)基本分析

從數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到具有ST型及pST型的來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株數(shù)據(jù)886 條，用于后續(xù)分析，國(guó)別（菌株數(shù)據(jù)量）分別為：孟加拉（7）、智利（19）、中國(guó)（包括大陸、香港和臺(tái)灣）（436）、丹麥（8）、厄瓜多爾（30）、德國(guó)（27）、洪都拉斯（2）、印度（3）、印度尼西亞（1）、日本（1）、韓國(guó)（1）、馬來(lái)西亞（1）、墨西哥（1）、荷蘭（3）、挪威（17）、西班牙（4）、斯里蘭卡（43）、泰國(guó)（116）、英國(guó)（1）、美國(guó)（161）、越南（4）。在886條數(shù)據(jù)中，共含有663 個(gè)ST型，其中ST3型（3、4、19、4、29、4、22）所含數(shù)據(jù)數(shù)最多，但也僅為27 條。在886 條菌株數(shù)據(jù)中，有436 條菌株數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)（包括大陸、香港和臺(tái)灣），覆蓋了410 個(gè)ST型，每個(gè)ST型含1～4 條菌株數(shù)據(jù)，這436 條菌株數(shù)據(jù)又可分為128 個(gè)pST型，其中pST1型為最多，達(dá)116 條菌株數(shù)據(jù)。

2.2 eBURST克隆復(fù)合體分析

采用eBURST分析，886 條菌株數(shù)據(jù)中，可以分為663 個(gè)ST型，包含了73 個(gè)組，483 個(gè)單體。其中CC34群為含ST型別最多的克隆復(fù)合體，包括了來(lái)自7 個(gè)ST型（ST34、ST334、ST35、ST77、ST324、ST95、ST33）的24 株菌株數(shù)據(jù)，這其中ST34型被認(rèn)為是CC34群的祖先型。CC3群為含菌株數(shù)最多的克隆復(fù)合體，包括了來(lái)自4 個(gè)ST型（ST3、ST266、ST220、ST2）的30 株菌株數(shù)據(jù)，其中ST3型被認(rèn)為是CC3群的祖先型。

2.3 STRUCTURE對(duì)亞群的劃分

STRUCTURE軟件分析結(jié)果顯示，LnP(D)和α1在亞群數(shù)為4時(shí)有明顯的拐點(diǎn)，因而確定來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株群體的適宜亞群數(shù)為4（圖1）。各亞群之間的F值變化范圍是0.010 1～0.012 2，平均值為0.011 1。STRUCTURE軟件分群各亞群內(nèi)樣品的平均距離為0.980 6～0.984 0，均值為0.981 7。

圖1 全球副溶血弧菌環(huán)境菌株群體歸屬于4 個(gè)亞群的后驗(yàn)概率圖Fig.1 A posteriori probability graph of worldwide environmental Vibrio parahaemolyticus strains belonging to 4 subgroups

2.4 AA-MLST數(shù)據(jù)基本分析

從數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到具有pST型的來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株數(shù)據(jù)886 條，共含有187 個(gè)pST型，其中pST1型（1、1、1、1、1、1、1）所含數(shù)據(jù)數(shù)最多，可達(dá)228 條。pST2型（2、1、1、1、1、1、1）所含數(shù)據(jù)數(shù)次之，可達(dá)188 條。根據(jù)pST型分析克隆群結(jié)構(gòu)，顯示pST75、pST92、pST221、pST178、pST153、pST79、pST148、pST125、pST142、pST147和pST175與其他pST型有多于1 個(gè)等位基因的差異。

2.5 最小生成樹(shù)的構(gòu)建

Bionumerics軟件應(yīng)用Prim算法，根據(jù)各等位基因型之間的差異對(duì)不同ST型進(jìn)行分組聚類，找到各ST型進(jìn)化關(guān)系上共同的祖先，最終生成最小生成樹(shù)（minimum spanning tree，MST）。在MST圖中（圖2、3），每個(gè)圓代表一種ST型，圓圈大小與菌株數(shù)目成正比。比較eBURST軟件與Bionumerics軟件的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種算法對(duì)克隆復(fù)合體及祖先ST型的認(rèn)定存在一定差異，而且Bionumerics軟件對(duì)基于MLST數(shù)據(jù)和AA-MLST數(shù)據(jù)的克隆復(fù)合體分析也存在差異。并不是同屬于一個(gè)ST型克隆復(fù)合體的菌株也會(huì)劃歸于同一pST型克隆復(fù)合體中。世界各地報(bào)道的副溶血弧菌環(huán)境菌株呈現(xiàn)出高度多態(tài)性，并沒(méi)有特別優(yōu)勢(shì)的克隆群存在，且副溶血弧菌的血清型分型與MLST分型及AA-MLST分型結(jié)果均表現(xiàn)出不同，基于ST型的分析找到比基于pST型數(shù)據(jù)分析更多的克隆復(fù)合體。

圖2 全球副溶血弧菌886 株環(huán)境菌株基于MLST分型方案數(shù)據(jù)的最小生成樹(shù)Fig.2 Minimum spanning tree based on MLST of 886 worldwide environmental Vibrio parahaemolyticus strains

由圖3可知，有些ST型的分布比較局限，僅分布于一個(gè)國(guó)家或一個(gè)大洲，而有些ST型則廣泛分布于多地，如ST3型在美洲、拉丁美洲、亞洲均有分布；ST711型分布于拉丁美洲和亞洲；ST539型分布于拉丁美洲和美洲；ST471型分布于歐洲和亞洲；ST424型分布于亞洲和拉丁美洲；ST246分布于拉丁美洲和亞洲；ST141型也歐洲和美洲均被發(fā)現(xiàn)；ST121型目前在歐洲和亞洲均被檢測(cè)到；ST114型為美洲和亞洲分布；ST56型為拉丁美洲和亞洲分布；ST28型分布于拉丁美洲和歐洲；ST12型分布于美洲和亞洲；ST6型分布于拉丁美洲和歐洲。亞洲有507 個(gè)ST型，歐洲有38 個(gè)ST型，美洲有94 個(gè)ST型別，拉丁美洲有36 個(gè)ST型別。由此可見(jiàn)，亞洲的副溶血弧菌環(huán)境分離株的型別和多樣性要顯著高于其他洲。

圖3 全球副溶血弧菌886 株環(huán)境菌株基于AA-MLST分型方案數(shù)據(jù)的最小生成樹(shù)Fig.3 Minimum spanning tree based on AA-MLST of 886 worldwide environmental Vibrio parahaemolyticus strains

3 討 論

國(guó)內(nèi)外副溶血弧菌食物中毒暴發(fā)主要原因與生食海鮮和海產(chǎn)品污染有關(guān)[18]。也包括肉制品、腌制品和一些涼菜等[19]，由副溶血弧菌引起的食物中毒事件居細(xì)菌性食物中毒的首位[20-21]，開(kāi)展全球副溶血弧菌環(huán)境菌株的群體遺傳學(xué)特征研究對(duì)中國(guó)的副溶血弧菌的預(yù)防控制具有重要意義。在副溶血弧菌中，血清學(xué)在追溯流行性克隆復(fù)合體傳播上是不可靠的[16]。而MLST是以選定的管家基因序列分析為基礎(chǔ)的，可更好地揭示同一個(gè)屬中菌株間的遺傳親緣關(guān)系[22]。2014年，有研究者對(duì)來(lái)自國(guó)際上17 個(gè)沿海城市的副溶血弧菌臨床菌株進(jìn)行了MLST分析，發(fā)現(xiàn)490 株菌可分為161 個(gè)ST型，8 個(gè)克隆群復(fù)合體，其中以CC3型為主[23]。本研究采用來(lái)自PubMLST公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的來(lái)自全球地區(qū)的副溶血弧菌環(huán)境菌株，進(jìn)行了MLST及AA-MLST分型方案分析，研究全球副溶血弧菌環(huán)境菌株的群體結(jié)構(gòu)和克隆群復(fù)合體組成。從數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到具有ST型及pST型的來(lái)自全球的副溶血弧菌環(huán)境菌株數(shù)據(jù)886 條，共含有663 個(gè)ST型，這說(shuō)明來(lái)自全球地區(qū)的副溶血弧菌環(huán)境菌株的高度多態(tài)性。其中有436 條菌株數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)（包括大陸、香港和臺(tái)灣），覆蓋了410 個(gè)ST型。由此可以看出，副溶血弧菌的環(huán)境菌株比臨床菌株體現(xiàn)出更高的遺傳多樣性。因?yàn)楦比苎【h(huán)境菌株的遺傳高度多態(tài)性，因此確定菌株之間遺傳相關(guān)可能缺乏可信度，因此基于肽鏈順序的AA-MLST方案可能更適合副溶血弧菌的群組結(jié)構(gòu)分析[24]，于是在本研究中也采用了基于pST型的分析。從結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)有些型別是跨洲分布的，這提示這些型別可能更適合外界壞境，有著更廣泛的分布，人們?cè)谕猸h(huán)境監(jiān)測(cè)時(shí)需格外注意這些型別的發(fā)現(xiàn)。亞洲的副溶血弧菌環(huán)境分離株的型別和多樣性要顯著高于其他洲，這提示作為亞洲國(guó)家，應(yīng)該密切關(guān)注副溶血弧菌在環(huán)境中的進(jìn)化變異。與其他研究結(jié)果一致[21]，本結(jié)果也顯示副溶血弧菌的血清型分型對(duì)其流行病學(xué)研究?jī)r(jià)值有限。因此，本研究認(rèn)為在副溶血弧菌的監(jiān)測(cè)中，應(yīng)將分子分型納入到菌株分型中，在全球副溶血弧菌環(huán)境菌株整體呈現(xiàn)高度多態(tài)性的大環(huán)境下，也應(yīng)該引起我國(guó)專業(yè)技術(shù)人員和食品安全監(jiān)督部門的警示，對(duì)于環(huán)境中的副溶血弧菌可能引起的養(yǎng)殖和食品加工過(guò)程中的污染，尤其是海產(chǎn)品，比如副溶血弧菌傳播的主要媒介：蝦、蟹、牡蠣等海產(chǎn)品污染食品中的副溶血弧菌要加大監(jiān)測(cè)力度，此外，在監(jiān)測(cè)工作中的重點(diǎn)是關(guān)注不同克隆群的副溶血弧菌，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)和管理，這樣可及時(shí)掌控分離自環(huán)境中的副溶血弧菌的群體遺傳構(gòu)成、優(yōu)勢(shì)菌群變化，預(yù)警致病類似菌株在海產(chǎn)品中的分布變化以及可能的危險(xiǎn)食品，為暴發(fā)疫情和人群中流行菌株的溯源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，采取必要的措施減少食源性疾病暴發(fā)和流行[25]。

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Multilocus Sequence Typing of Global Environmental Strains of Vibrio parahaemolyticus Based on Nucleotide and Peptide Sequences

XU Jialiang1, DU Xiaoli2, LU Xin2,*
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

Objective: To understand the group structure and clonal complex of worldwide environmental Vibrio parahaemolyticus strains. Methods: Worldwide environmental V. parahaemolyticus strains with complete sequence types (ST) and peptide sequence types (pST) were screened from the PubMLST public database, the subgroup analysis and complex analysis was conducted, and the minimum spanning tree was established based on ST and pST types. Results: From the database, 886 items were screened for analyzing the ST and pST types of worldwide environmental V. parahaemolyticus strains, which belonged to 663 ST types with ST3 type being the most dominant, but only containing information on 27 strains. Out of these, 436 items came from China (including mainland, Hong Kong and Taiwan), including 410 ST types, each of which contained information on 1-4 strains and these 436 strains could be divided into 128 pST types, with pST1 type being the most dominant type, containing information on 116 strains. The eBURST software was used to analyze the data and 73 groups and 483 singletons were observed. Analysis with the software STRUCTURE showed that appropriate subset number of global V. parahaemolyticus strains was 4, and the average distance between samples in each subgroup was 0.981 7. Conclusion: Worldwide environmental V. parahaemolyticus strains in Asia are characterized by high polymorphism and can be subdivided into 4 subgroups. ST3 type is the most dominant strain when MLST typing is used while pST1 type is the most dominant strain by AA-MLST typing.

Vibrio parahaemolyticus; multilocus sequence typing; peptide based multilocus sequence typing; clonal complex

Q939.99

A

1002-6630（2015）21-0095-05

10.7506/spkx1002-6630-201521019

2015-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31400161）；北京工商大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（QNJJ2014-25）

徐嘉良（1984—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全控制。E-mail：xujialiang@btbu.edu.cn

*通信作者：盧昕（1981—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槟c道致病微生物的進(jìn)化分析。E-mail：luxin@icdc.cn