芒果不同噴藥期多菌靈殘留量的測定

林 玲1，2，楊春亮1，2*，查玉兵1，2，郭宏斌1，2，曾紹東1，2，曾日中3

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江 524001；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東湛江 524001；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南儋州 571737)

摘要[目的]建立一種測定芒果果實(shí)中多菌靈殘留量的高效液相色譜法。[方法]利用高效液相色譜法測定芒果不同噴藥時間多菌靈的殘留量，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]多菌靈農(nóng)藥殘留較高，且基本上呈施藥后間隔期越短，農(nóng)藥殘留越高的趨勢。采前7 d多菌靈農(nóng)藥殘留達(dá)到1.20 mg/kg，間隔期7～30 d多菌靈殘留介于0.09～1.20 mg/kg，采前35 d多菌靈殘留量為未檢出。多菌靈的檢出限為0.02 mg/kg，平均回收率在85%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、操作簡便、靈敏度高，能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

關(guān)鍵詞高效液相色譜；多菌靈；芒果

中圖分類號S481+.8

基金項(xiàng)目中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630022013007)；國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項(xiàng)目(GJFP2015012)。

作者簡介林玲(1978- )，女，海南?？谌?，副研究員，碩士，從事農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究。*

收稿日期2015-07-30

Determination of Carbendazim Residue of Different Interval in Mango Fruit by HPLC

LIN Ling1,2, YANG Chun-liang1,2*, ZHA Yu-bing1,2et al(1.Agriculture Products Processing Research Institute, CATAS, Zhanjiang, Guangdong 524001; 2.Laboratory of Agricultural Products Processing Quality and Safety Risk Evaluation, Ministry of Agriculture, Zhanjiang, Guangdong 524001)

Abstract[Objective] The aim was to establish a determination of Carbendazim residue in mango fruit by HPLC. [Method] The Carbendazim residue of different interval in mango fruit was determined by HPLC and external standard method. [Result] There was higher Carbendazim residue in mango fruit, furthermore the shorter spraying interval was, the higher Carbendazim residue was. The residue of Carbendazim reached 1.20 mg/kg in 7 days before harvest; the residues of Carbendazim were between 0.09 mg/kg and 1.20 mg/kg during the interval from 7 days to 30 days; carbendazim residue was not detected in 35 days before harvest. Under the selected conditions, the limit of Carbendazim detection was 0.02 mg/kg, and the average recoveries were 85%-105%, and relative standard deviation was less than 4%. [Conclusion] The method was accurate, simple and sensitive, and could satisfy the demand of pesticide residue analysis.

Key wordsHPLC; Carbendazim; Mango fruit

芒果是繼香蕉之后的世界第二大熱帶水果，有“熱帶果王”的美稱。截至2009年底，我國芒果栽培總面積達(dá)13.11萬hm2，產(chǎn)量達(dá)89.41萬t，種植面積和產(chǎn)量逐年增長。我國已成為世界芒果主產(chǎn)國之一，主要分布在海南、廣東、廣西、云南、四川攀枝花、福建等地區(qū)，是我國熱區(qū)農(nóng)民的重要經(jīng)濟(jì)來源之一。芒果在田間生長及采后貯運(yùn)過程中遭受著多種病蟲害。迄今為止，國內(nèi)外已報道可危害芒果的病害就有50多種[1]。其中，炭疽病是其發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的一種病害，主要為害芒果葉片、嫩梢、花序和果實(shí)。同時，由于其病原菌具有潛伏侵染的特性，會從開花期、幼果期侵入，在侵染果實(shí)的過程中以侵染性菌絲體、附著胞和(或)侵入釘?shù)惹秩窘Y(jié)構(gòu)在果實(shí)表面或表皮內(nèi)處于潛伏狀態(tài)，在果實(shí)的表面上沒有任何病害跡象，至果實(shí)貯運(yùn)期，隨著果實(shí)的后熟，侵染結(jié)構(gòu)又恢復(fù)活動，使果實(shí)迅速腐爛，甚至整個果實(shí)失去食用價值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

多菌靈是一種高效、低毒、廣譜內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑，兼具防治兩重作用，是用于防治炭疽病的理想藥劑[2]。除了農(nóng)藥對病蟲害的防治效果外，農(nóng)藥的安全使用問題也日益得到人們的關(guān)注，目前，國內(nèi)外已制定多種農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟許多國家和我國相繼對蔬菜、水果中的多菌靈最高殘留限量進(jìn)行了規(guī)定[3]。測定多菌靈殘留量的常用檢測方法主要有高效液相色譜法和高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法，樣品主要集中在蔬菜、水果、茶葉、藥材等方面[4-8]。關(guān)于多菌靈在芒果上的殘留檢測方面的研究目前未見報道。為了對多菌靈在芒果上的安全間隔期進(jìn)行合理評價，筆者利用高效液相色譜法對芒果不同噴藥時間多菌靈的殘留量進(jìn)行了測定，以期為生產(chǎn)上合理施用多菌靈農(nóng)藥提供參考。

1材料與方法

1.1材料99.8%多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈、甲醇均為色譜純，二氯甲烷、氯化鈉等均為分析純。50%多菌靈可濕性粉劑：按其說明書介紹的大田施用濃度配制藥液。

1.2方法

1.2.1溶液的配制。

1.2.1.1甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)。量取5.00 ml甲醇和95.00 ml二氯甲烷，混勻后備用。

1.2.1.2多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取10.0 mg多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品于25.00 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.400 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下避光保存。

1.2.1.3多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液。量取適量多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.1.4離子對試劑。吸取7.00 ml磷酸于200.00 ml水中，加入1.0 g 葵烷磺酸鈉，溶解，再加入10.00 ml三乙胺，稀釋至1 000 ml。

1.2.2芒果田間噴霧處理。試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，選擇一片5年以上樹齡長勢均勻的地塊，田間各項(xiàng)管理采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)控制。試驗(yàn)設(shè)5個處理，每個處理5棵樹，分別于采前35、30、25、20、15、7 d進(jìn)行噴霧處理，噴藥時間設(shè)在09：00～11：00，天氣為晴天，氣溫為25～33 ℃，藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍稀釋液，用小型手提式噴霧器將配制好的藥劑均勻噴布于供試植株果實(shí)上，果實(shí)收獲時，對每個采前間隔期均隨機(jī)取5個果實(shí)進(jìn)行殘留檢測。

1.2.3樣品的提取與凈化。參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1680-2009[9]和NY/T 761-2008[10]并稍做修改。

1.2.3.1提取。稱取5.0 g打漿均勻的果肉，加入20.00 ml乙腈，加7.0 g氯化鈉，渦旋混合2 min，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心8 min，吸取5.00 ml乙腈離心液放入燒杯中，于80 ℃水浴中加熱氮吹，將乙腈蒸發(fā)近干，加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷(5+95)溶解殘渣，待凈化。

1.2.3.2凈化。將氨基柱用4.00 ml甲醇+二氯甲烷(5+95)預(yù)洗后立即加入“1.2.3.1”待凈化液，收集洗脫液，再加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷(5+95)溶解殘渣后過柱，并重復(fù)1次，將收集的洗脫液置于氮吹儀上，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2.00 ml，混勻后用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.2.4色譜條件。Symmetry C18250.0 mm×4.6 mm色譜柱，柱溫：30 ℃，Waters2996二極管陣列檢測器，檢測波長為275 nm，流動相比例為甲醇-水(40∶60，V/V)，流速為1.0 ml/min。

1.2.5檢測波長的選擇。取濃度為0.80 μg/ml的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二極管陣列檢測器在190～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最佳檢測波長。

1.2.6流動相的選擇。比較甲醇-離子對試劑和甲醇-水2種流動相組成對目標(biāo)物色譜峰峰形和分離度的影響，確定最適宜的流動相。

1.2.7方法的線性關(guān)系和相關(guān)性。對濃度為0.1、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/ml的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度(X)和其對應(yīng)的峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，確定方法的準(zhǔn)確度和相關(guān)系數(shù)。

1.2.8精密度、回收率和最低檢出限。取芒果對照空白樣品分別添加3個濃度水平的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品添加濃度分別為0.2、0.5和1.0 mg/kg，按“1.2.3”步驟處理，每個濃度做3個平行測定，根據(jù)測定結(jié)果計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以3倍信噪比計算最低檢出限。

2結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確定按“1.2.5”的方法對190～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)多菌靈在275 nm處有最大吸收，且基線噪音相對較小，色譜峰的信噪比更理想。因此，選擇275 nm作為檢測波長。

2.2流動相的確定結(jié)果表明，在甲醇-水體積比為40∶60的色譜條件下，目標(biāo)峰分離效果最好，基線較平穩(wěn)，且噪音干擾小，雜質(zhì)峰與多菌靈的峰能完全分開。而采用甲醇-離子對試劑做流動相，目標(biāo)峰也能分離，但離子對試劑不穩(wěn)定，峰有拖尾，基線噪聲大，所以選擇甲醇-水做流動相。

2.3方法的相關(guān)性評價結(jié)果表明，多菌靈在0.10～4.00 μg/ml 范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。線性方程為Y=1 344X-1 125，相關(guān)系數(shù)(r)等于0.999 2，表明線性關(guān)系良好，可滿足定量分析的需要。

2.4精密度、回收率和最低檢出限標(biāo)準(zhǔn)、樣品加標(biāo)色譜分別見圖1、圖2。由表1可知，多菌靈回收率為85%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～3.9%。多菌靈的最低檢出限為0.02 mg/kg。

表1　樣品回收率與精密度測定結(jié)果( n=3)

圖1　多菌靈標(biāo)準(zhǔn)色譜(0.80 μg/ml)

圖2　樣品添加色譜

2.5多菌靈在芒果果實(shí)上的殘留量結(jié)果表明，多菌靈在芒果上的殘留較明顯。采前7 d多菌靈農(nóng)藥殘留最高，達(dá)到1.20 mg/kg，采前35 d多菌靈農(nóng)藥殘留量沒有檢出，采前15～30 d多菌靈殘留介于0.09～1.20 mg/kg，果實(shí)收獲時農(nóng)藥殘留量隨著間隔期的變化總體上呈現(xiàn)施藥后間隔期越短農(nóng)藥殘留越高的趨勢。

3討論

隨著熱帶水果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，尤其是熱帶大宗水果大面積的栽培，其病蟲害問題日益嚴(yán)重。而化學(xué)防治是病蟲害防治的一項(xiàng)重要手段，然而有些殺蟲、殺菌劑農(nóng)藥的不合理使用或?yàn)E用農(nóng)藥不僅起不到防治病蟲害的目的，還會對環(huán)境造成污染等問題。因此，人們對某種農(nóng)藥進(jìn)行藥效篩選、毒性測定的同時，還需要對其在某種水果或其他作物上的安全間隔期進(jìn)行研究，以免造成農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，危害人類身體健康。

該研究采用Waters高效液相色譜法分析芒果果實(shí)中多菌靈的殘留量，使用甲醇-水為流動相，添加回收率為85%～105%，最低檢出限為0.02 mg/kg。該方法準(zhǔn)確、操作簡便，靈敏度高，能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

劉承蘭等[11]采用丙酮提取蘆筍樣品中的多菌靈和吡蟲啉農(nóng)藥殘留，用石油醚和二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容。該法步驟較繁瑣，耗費(fèi)時間長，提取溶劑用量大，色譜條件流動相甲醇-水體積比為40∶60，與該研究所建立的色譜流動相相似。李海飛等[12]用高效液相色譜法快速測定水果中的3種苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈)殘留量，用乙腈提取，樣品提取、色譜流動相與該試驗(yàn)條件相似，但檢測波長為285 nm。NY/T 761-2008[10]蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定的前處理與該方法的前處理基本一致，只是該方法的操作更加簡單，且該方法的色譜條件也更加優(yōu)化，又相對環(huán)保。精密度高、穩(wěn)定性好，回收率較高，說明該研究的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，可用于分析芒果等水果中多菌靈的殘留量。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2014[13]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定多菌靈農(nóng)藥在芒果中殘留最大限量為0.50 mg/kg，CAC對芒果的規(guī)定為2.00 mg/kg，而歐盟則規(guī)定為0.10 mg/kg。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，該研究在采前7 d處理的多菌靈最大殘留量為1.20 mg/kg，采前30 d處理的多菌靈殘留量為0.09 mg/kg，低于國際上要求較嚴(yán)格的歐盟標(biāo)準(zhǔn)。可見，多菌靈殺菌劑在芒果上的降解速度慢，安全間隔期較長，根據(jù)檢測結(jié)果，考慮到該藥劑的毒性，建議多菌靈在芒果上的安全使用時間是采前30 d施用，使該藥物殘留降到最低。該研究結(jié)果為指導(dǎo)芒果生產(chǎn)中合理、安全地施用多菌靈農(nóng)藥提供了參考。

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