生物信息學(xué)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

李靖宇

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021)

摘要高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展極大地推動(dòng)了微生物多樣性的研究，各種生物信息學(xué)軟件的開發(fā)用于分析由此產(chǎn)生的大量基因信息。綜述了生物信息學(xué)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用以及相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)在α、β-多樣性研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞生物信息學(xué)；微生物生態(tài)學(xué)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)S188;X172

基金項(xiàng)目北方民族大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(44/4400302502)。

作者簡(jiǎn)介李靖宇(1986-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，講師，從事環(huán)境微生物學(xué)研究。

收稿日期2015-06-11

Application of Bioinformatics in Microbial Ecology

LI Jing-yu (College of Biological Science & Engineering, Beifang University of Nationality, Yinchuan, Ningxia 750021)

AbstractThe rapid development of high-throughput sequencing technology has greatly promoted the study of microbial diversity, and various development of bioinformatics software was used to analyze a large number of genes generated by using this technology. This paper summarizes application of bioinformatics in microbial ecology and their corresponding software and synthesis databases used in α, β-diversity studies.

Key words Bioinformatics; Microbial ecology; Application

微生物生態(tài)學(xué)的主要任務(wù)之一是研究不同環(huán)境中微生物類群的組成、結(jié)構(gòu)以及生態(tài)功能。其中多樣性研究是一項(xiàng)重要的內(nèi)容，目前的研究手段主要是基于可培養(yǎng)的方法和基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法。后者粗略地可分為指紋圖譜技術(shù)與測(cè)序技術(shù)兩大類。所有這些技術(shù)或方法的建立，都是為了解決微生物生態(tài)學(xué)的一個(gè)核心問題，最大限度地描述自然環(huán)境中微生物的群落組成或者是群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化過程。在描述的環(huán)節(jié)中，需要獲得一些具體參數(shù)，直觀地表現(xiàn)自然環(huán)境中微生物群落的基本情況。一般從以下幾個(gè)方面來(lái)描述，主要有特定環(huán)境中微生物各類群的組成情況、相對(duì)豐度，多樣性指數(shù)(如Shannon、Simpson指數(shù)等)以及估計(jì)物種總數(shù)的指數(shù)(如Richness、ACE、Chao1)，物種親緣關(guān)系分析，分類學(xué)鑒定等內(nèi)容?；诓煌夹g(shù)對(duì)微生物多樣性，即通過指紋圖譜技術(shù)或測(cè)序技術(shù)來(lái)描述，后續(xù)所需要的分析手段不同。這2種技術(shù)獲得數(shù)據(jù)主要以圖譜的形式和基因序列的形式呈現(xiàn)，特別是近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的基因序列信息，雖然可以人工處理這些數(shù)據(jù)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易產(chǎn)生人為錯(cuò)誤等，這就需要引入新的、高效的分析手段，因此，生物信息學(xué)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。

1 生物信息學(xué)軟件概述

針對(duì)微生物生態(tài)研究的技術(shù)手段，后續(xù)分析的各種生物信息學(xué)軟件快速發(fā)展，主要包括基礎(chǔ)分析的軟件，如ClusterW、CLC Sequence Viewer、BioEdit、ARB等；親緣關(guān)系分析的軟件，如Mage、Phylip、PAUP、ARB等；指紋圖譜分析軟件，如Quantity One、T-Alin、T-REX等；群落結(jié)構(gòu)比較的軟件，如Libshuff、∫- Libshuff 、UniFrac、Fast-UniFrac等；多樣性指數(shù)分析軟件，如DOTUR等；序列提交的軟件，如Sequin、BankIt、Sequence Read Archive等；高通量數(shù)據(jù)/綜合分析軟件，如Mothur、Qiime、RDP Pipeline等。基于培養(yǎng)或基于DNA分子技術(shù)獲得微生物物種基因信息，可以在NCBI/EMBL/DDBJ、RDP以及Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)、分類鑒定(圖1)[1-21]。

這些軟件是基于Pyton、C++、Java、PHP、Perl等語(yǔ)言編寫的，可以在線使用，也可以下載使用，具體要求針對(duì)不同軟件而有所不同，大多數(shù)軟件可以在Windows、Linux、Mac OS 等系統(tǒng)下安裝與運(yùn)行，有一些軟件在Windows下無(wú)法安裝與運(yùn)行，需要在Windows系統(tǒng)上安裝Virtual Box來(lái)運(yùn)行這些軟件，如Qiime軟件。但這些軟件都帶有詳細(xì)、具體的使用操作說(shuō)明，所以很容易學(xué)習(xí)與使用[1-21]。

2生物信息學(xué)軟件的應(yīng)用

生物信息學(xué)軟件的進(jìn)步提高了解釋相關(guān)微生物生態(tài)學(xué)問題的能力。伴隨著軟件，如ARB、DOTUR、LIBSHUFF、UniFrac、HOMOVA、AMOVA、TreeClimber以及rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的快速發(fā)展(表1)，微生物生態(tài)學(xué)已經(jīng)從描述性階段發(fā)展到試驗(yàn)嘗試階段。雖然這些工具已廣泛使用，但隨著測(cè)序能力的不斷提高以及研究?jī)?nèi)容越來(lái)越復(fù)雜，這些軟件還有許多局限之處。首先，對(duì)于一些容易使用的rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)擁有在線分析工具，主要包括序列比對(duì)、基因信息物種分類、分析流程；然而，這些工具只能做有限的一般性分析，值得疑問的是把巨大的數(shù)據(jù)集通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行分析是不是一個(gè)可持續(xù)的實(shí)踐。第二，許多現(xiàn)有軟件的開發(fā)僅適用于分析102～104條序列。隨著序列數(shù)量的不斷增多，至關(guān)重要的是把現(xiàn)有的軟件進(jìn)行重構(gòu)，使用更高效的算法。此外，盡管已經(jīng)使用腳本語(yǔ)言，如Perl和Python用于在線分析較小的數(shù)據(jù)集，但它們相比用C和C++編寫的代碼在運(yùn)行速度上慢得多。最后，現(xiàn)有軟件的特征限制了他們的集成和進(jìn)一步發(fā)展。隨著測(cè)序能力的不斷提高以及研究?jī)?nèi)容越來(lái)越復(fù)雜，關(guān)鍵的問題是軟件的開發(fā)要靈活和易于維護(hù)。Mothur是美國(guó)密歇根大學(xué)的Patrick D. Schloss在2009年開發(fā)的一個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)處理平臺(tái)，它的前身是Dothur軟件。Mothur軟件使用現(xiàn)代的面向?qū)ο蟮木幊滩呗裕肅++編寫，無(wú)需安裝，在Windows、Linux和Mac OS系統(tǒng)上都可以運(yùn)行。它整合了Pyrosequencing pipeline (RDP)、NAST、SINA、RDP aligners、DNADIST、DOTUR 、CD-HIT、SONS、TreeClimber、∫- Libshuff 和UniFrac，在運(yùn)算法則上做了一些改進(jìn)，使得Mothur這個(gè)軟件更加靈活、速度更快、資源利用效率更高。但Mothur不能夠直接出圖，必須依賴于其他軟件，如R語(yǔ)言。除羅氏454數(shù)據(jù)處理外，Mothur目前也有了針對(duì)Illumina數(shù)據(jù)的處理方式，從Mothur官方網(wǎng)頁(yè)上即可以看到Patrick D. Schloss寫的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理流程[1]。

另一個(gè)被廣泛使用的高通量數(shù)據(jù)處理平臺(tái)是QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)，是美國(guó)科羅拉多Rob Knight及其開發(fā)團(tuán)隊(duì)等于2009年開發(fā)出來(lái)的。QIIME只能在Mac OS和Linux系統(tǒng)上運(yùn)行，也可以通過在Windows系統(tǒng)上安裝Virtual Box來(lái)運(yùn)行。QIIME支持多種微生物群落結(jié)構(gòu)的分析與可視化，包括網(wǎng)絡(luò)分析、樣品內(nèi)或樣品間多樣性的直方圖以及分析是否在特定的棲息地存在具有代表性的“核心”微生物類群。QIIME還提供了允許用戶與數(shù)據(jù)進(jìn)行交互的圖形化顯示。軟件的實(shí)現(xiàn)是高度模塊化的，并大量使用單元測(cè)試確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。這種調(diào)整可以使具有其他功能的選擇性組件，如選擇操作分類單元，序列比對(duì)，推斷系統(tǒng)發(fā)育樹和基于系統(tǒng)發(fā)育和分類單元的樣品內(nèi)及樣品間多樣性分析(包括第三方應(yīng)用程序的整合)變得容易被集成與整合[2]。

無(wú)論使用哪個(gè)軟件，都可以很好地處理細(xì)菌16S rRNA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，因?yàn)镸othur和QIIME都包含了細(xì)菌16S rRNA比對(duì)和分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。如果是古菌16SrRNA的數(shù)據(jù)，雖然RDP、Greengenes、SILVA等數(shù)據(jù)庫(kù)可以用來(lái)分析多樣性，但分類效果較差。因?yàn)楣啪募兣囵B(yǎng)很少，分類仍處于發(fā)展階段。如果是功能基因，就面臨更大的難題。數(shù)據(jù)處理的難點(diǎn)主要有：第一，比對(duì)沒有可供使用的參考數(shù)據(jù)庫(kù)；第二，分類需要序列經(jīng)過比對(duì)之后，分成不同的OTU，然后從每個(gè)OTU中選擇一個(gè)代表序列，通過BLAST進(jìn)行分類。鑒于這些缺陷與不足，目前對(duì)于研究功能基因的微生物生態(tài)學(xué)問題，可以使用基因芯片(microarray)以及DGGE或者是T-RFLP等方法[1-2]。

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)是研究微生物群落的另一種高通量技術(shù)，可以產(chǎn)生大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)集。盡管在不斷地完善與改進(jìn)，這些數(shù)據(jù)的分析還是需要很多步驟和數(shù)據(jù)操作才能解釋這些結(jié)果。這些步驟通常成為數(shù)據(jù)分析的障礙，浪費(fèi)時(shí)間，且容易引入人為的分析錯(cuò)誤。目前，分析數(shù)據(jù)的最大障礙主要有：第一，真?zhèn)畏宓膮^(qū)分；第二，所有樣品中峰值的比對(duì)；第三，從原始數(shù)據(jù)創(chuàng)建一個(gè)關(guān)于樣品的二維數(shù)據(jù)矩陣；第四，數(shù)據(jù)矩陣的快速處理；第五，確定哪一種多變量分析更適合某一特定的數(shù)據(jù)集。為了克服這些障礙，可以通過T-REX、TAP-TRFLP、MiCA、PAT、TRAMPR對(duì)T-RFLP技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析[3-7]。但這些程序之間的特性和功能差別很大，大多數(shù)程序最初并不主要是用來(lái)分析T-RFLP數(shù)據(jù)的。T-REX是一個(gè)免費(fèi)的、基于Web的工具，只需通過Web瀏覽器聯(lián)網(wǎng)即可對(duì)T-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[7]。這個(gè)程序的具體使用在官網(wǎng)上有詳細(xì)的操作流程，其中對(duì)數(shù)據(jù)處理執(zhí)行特定功能的菜單按鈕在很大程度上是獨(dú)立的，可以在任何時(shí)候使用任何一個(gè)按鈕，而不需要重新加載或上傳相同的數(shù)據(jù)。

芯片技術(shù)需要對(duì)大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效地組織和分析。這些數(shù)據(jù)包括樣品雜交的信息、雜交圖像及從中提取的數(shù)據(jù)矩陣以及物理陣列、特征和報(bào)告分子的相關(guān)信息。有許多獨(dú)立的軟件系統(tǒng)，可以解決芯片數(shù)據(jù)處理與分析的一些需求，如用于芯片數(shù)據(jù)聚類與可視化的數(shù)據(jù)庫(kù)和應(yīng)用程序、包含報(bào)告分子信息的公共數(shù)據(jù)庫(kù)、商業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)以及各種用于記錄生物材料注釋的存儲(chǔ)方法。然而，沒有一個(gè)統(tǒng)一的系統(tǒng)能夠有效地組織微陣列試驗(yàn)產(chǎn)生的所有信息以及用工具把這些信息進(jìn)行整合用于微陣列雜交數(shù)據(jù)的量化分析。為了滿足這些需求，BASE(BioArray Software Environment)提供了一個(gè)用于存儲(chǔ)和分析微陣列信息的集成框架[8-9]。BASE是一個(gè)MIAME(Minimum Information About a Microarray Experiment guidelines)支持的用戶自定義數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，可以在任何芯片實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行安裝并通過網(wǎng)絡(luò)為許多用戶提供同步服務(wù)。該軟件是在GNU / Linux的操作系統(tǒng)上用PHP語(yǔ)言開發(fā)的，數(shù)據(jù)被存儲(chǔ)在一個(gè)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)(MySQL)中，可以通過Apache Web服務(wù)器傳輸給用戶。如有需要，用戶界面可以使用Java以及JavaScript，且C++已經(jīng)被用于在服務(wù)器上計(jì)算密集型的任務(wù)?？傊?，這個(gè)系統(tǒng)集成了生物材料的信息、原始圖像以及數(shù)據(jù)提取的功能，并提供了一個(gè)插件框架用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)查看以及分析模塊[8-9]。PhyloChip是一種用于微生物調(diào)查的16S rRNA基因芯片，已成功用于研究一些有趣環(huán)境中的微生物多樣性。然而，它的使用受分析軟件缺乏的限制。 PhyloTrac解決了這一需求，是第一款提供PhyloChip全程分析的桌面應(yīng)用程序。通過多種集成顯示提供了豐富的、交互式可視化結(jié)果。 PhyloTrac是免費(fèi)的，通過整合PhyloChip芯片平臺(tái)與專用分析應(yīng)用程序?yàn)槲⑸镎{(diào)查提供了一個(gè)全面和易于使用的工具包[9]。

表1　 常用軟件匯總

3 基于α、β-多樣性的微生物生態(tài)學(xué)研究

微生物生態(tài)學(xué)研究中，α、β-多樣性研究尤為重要。α-多樣性主要是反映一個(gè)獨(dú)立群落中微生物種類的多少，度量方法主要包括Shannon、Simpson、Richness、ACE、Chao1等；β-多樣性測(cè)量時(shí)間或空間上微生物群落之間的差異，即使在相同類型的環(huán)境中取多個(gè)樣品得到的微生物群落也會(huì)有很大差異，目前應(yīng)用最普遍的度量方法是相似性(相異性)指數(shù)度量群落物種組成在時(shí)空尺度上的變化。根據(jù)數(shù)據(jù)的特征，可供選擇的指數(shù)很多，主要有用于二元數(shù)據(jù)的Sφrensen指數(shù)、Jaccard指數(shù)，用于數(shù)量數(shù)據(jù)的Bray-Curtis指數(shù)等。β-多樣性計(jì)算可依賴于分類作為基礎(chǔ)(如物種、屬或者是OTUs的重疊部分)或者依賴于親緣關(guān)系作為基礎(chǔ)(如進(jìn)化樹中的重疊部分)。親緣關(guān)系β-多樣性測(cè)量與基于分類計(jì)算的β-多樣性相比特別重要，可以解釋物種間的相似性與差異性，這些信息可以更加有效地反映生態(tài)型。針對(duì)不同環(huán)境樣品16S rRNA克隆文庫(kù)之間的微生物群落結(jié)構(gòu)比較已經(jīng)開發(fā)了一些統(tǒng)計(jì)技術(shù)，如S?renson、Jaccard、LibShuff 、∫- Libshuff、等級(jí)聚類以及基于序列在不同組中的分布進(jìn)行排序的技術(shù)等。由于這些技術(shù)沒有考慮序列之間相似性的不同程度，所以存在不足之處，但親緣關(guān)系距離的計(jì)算可以彌補(bǔ)這些不足。UniFrac是一種基于親緣關(guān)系的β-多樣性度量新方法，通過計(jì)算包含進(jìn)化分支的不同群落之間的距離可以同時(shí)比較多個(gè)樣品，其產(chǎn)生的UniFrac 矩陣可以用于多元統(tǒng)計(jì)分析[10-13]。這是一款在線分析軟件，使用Python程序語(yǔ)言編寫，為在微生物生態(tài)學(xué)中廣泛地使用這些技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。而且，這款軟件不斷改進(jìn)與完善，并逐步整合一些有效的分析方法。Fast UniFrac是UniFrac的升級(jí)版本，基于陣列的實(shí)現(xiàn)比基于樹的實(shí)現(xiàn)使用更少的內(nèi)存和存儲(chǔ)空間，可以使相同的硬件來(lái)處理更大的數(shù)據(jù)集。這些功能的增強(qiáng)使得以前最多只能分析50個(gè)樣品、5 000條序列、置換次數(shù)100次的運(yùn)行增加到200個(gè)樣品、100 000條序列、置換次數(shù)1 000次的運(yùn)行。第二代測(cè)序技術(shù)以及PhyloChip技術(shù)使得同時(shí)分析數(shù)以百計(jì)的微生物群落的親緣關(guān)系成為可能?；谌狈φ虾涂梢暬绱她嫶髷?shù)據(jù)集的能力，制約了人們對(duì)群落結(jié)構(gòu)的了解。Fast UniFrac克服了這些問題，允許在一次分析中整合大量的序列信息和樣品信息。新的三維可視化的主坐標(biāo)分析結(jié)果(同時(shí)可選擇多個(gè)坐標(biāo)軸)提供了一個(gè)強(qiáng)大的方法來(lái)識(shí)別大量的微生物群落的生態(tài)類型。升級(jí)后的UniFrac既可以用于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，也可以用于PhyloChip技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)分析[12]。

4 綜合數(shù)據(jù)庫(kù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

利用分子生物學(xué)技術(shù)編目和保護(hù)地球上生物多樣性的認(rèn)識(shí)在提高、動(dòng)機(jī)在加強(qiáng)，這就需要涵蓋三域生命分類系統(tǒng)的綜合知識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)[14-21]。16S小亞基rRNA基因常用于調(diào)查微生物群落的組成，推斷細(xì)菌和古細(xì)菌的進(jìn)化以及設(shè)計(jì)監(jiān)測(cè)和分析工具，如基因芯片。由于未培養(yǎng)微生物16S小亞基rRNA基因序列的記錄產(chǎn)生的速率遠(yuǎn)超過代表可培養(yǎng)微生物的序列記錄，分類放置序列已經(jīng)相對(duì)滯后。這些代表不可培養(yǎng)微生物以及可培養(yǎng)微生物的16S小亞基rRNA序列是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到，因此存在嵌合體序列，這些低質(zhì)量的序列會(huì)被提交到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，如NCBI/EMBL/DDBJ，進(jìn)而導(dǎo)致微生物分類的相互沖突以及錯(cuò)誤采用嵌合體序列推斷系統(tǒng)發(fā)育或作為參考序列設(shè)計(jì)探針/引物的概率明顯增加[14-21]。要想充分利用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠的系統(tǒng)發(fā)育重建和生物多樣性分析，進(jìn)行每條序列的仔細(xì)檢查和比對(duì)非常必要。特別是最近推出的快速、便宜的測(cè)序技術(shù)，如焦磷酸測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)了需要建立綜合的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)庫(kù)用于微生物群落的比較。伴隨著小亞基(Ribosomal Small Subunit，SSU)和大亞基(Ribosomal Lager Subunit，LSU)rRNA序列的

快速增加，這就需要專門的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)的軟件工具。目前有4個(gè)項(xiàng)目提供了人為策劃構(gòu)建的rRNA序列和比對(duì)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)：比利時(shí)根特大學(xué)建立的歐洲核糖體rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，美國(guó)密歇根州立大學(xué)建立的Ribosomal Database Project II數(shù)據(jù)庫(kù)，美國(guó)勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室建立的GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)以及德國(guó)馬克斯·普朗克海洋微生物學(xué)研究所建立的Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[14-21]。4個(gè)項(xiàng)目都提供了至少包含16S rRNA基因的數(shù)據(jù)庫(kù)，但每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)含有的序列數(shù)量、質(zhì)量檢查方法、比對(duì)方法以及更新程序有所不同。ARB項(xiàng)目是唯一一個(gè)整合了同源小亞基(SSU)以及大亞基(LSU)的平臺(tái)，覆蓋了生命的三域分類系統(tǒng)，即細(xì)菌域、古生菌域(16S/23S)和真核生物域(18S/28S)的序列。所有項(xiàng)目都提供了基于網(wǎng)絡(luò)的軟件工具用于序列的比對(duì)和分類以及探針匹配功能。此外，GreenGenes提供了可與ARB兼容的全長(zhǎng)序列(>1 250個(gè)堿基)的細(xì)菌和古細(xì)菌數(shù)據(jù)集[14-21]。

5 展望

綜上所述，微生物生態(tài)學(xué)研究中，技術(shù)進(jìn)步十分關(guān)鍵，數(shù)據(jù)分析軟件的開發(fā)與完善也同等重要，兩者缺一不可。

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