王耀松，吳滿剛

1(南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京，210037)

2(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州，225127)

乳清蛋白是奶酪制作的副產(chǎn)物［1］，主要成分是α乳白蛋白(αLa)和 β 乳球蛋白(βLg)［2］。近年來，蛋白的成膜性很受關(guān)注［3］，這主要是因為乳清蛋白能夠形成透明、彈性、無色的膜［4］，可作為食品包裝、涂膜材料［5］。由于生產(chǎn)成本和技術(shù)發(fā)展的原因，以及不同食品對包裝材料功能多樣性的要求，人們需要探索不同的技術(shù)以提升膜的實際應(yīng)用價值。

目前對膜材料改造的技術(shù)已經(jīng)大大改善了膜材料的功能性［6-10］，這些技術(shù)的一個共同策略是促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間共價交聯(lián)。然而，基于生產(chǎn)成本和食品安全的要求，非常有必要尋找新的交聯(lián)手段。前人報道中顯示羥基自由基能夠修飾蛋白，并促進(jìn)分子間的共價交聯(lián)［11-14］。事實上，在塑料工業(yè)中催化單體小分子交聯(lián)形成高分子［15］以及眾多親水膠體制備［16］中廣泛應(yīng)用這種自由基;因此有理由認(rèn)為它也可修飾蛋白膜材料，從而作為一種共價交聯(lián)手段。另外，乳清蛋白原料在貯藏過程中氧化反應(yīng)是不可避免的，特別是羥基自由基引起的自然氧化現(xiàn)象［17］，其結(jié)果可能造成肽鏈斷裂，側(cè)鏈氨基的修飾以及斷裂下來的肽或蛋白質(zhì)分子間(內(nèi))分子的交聯(lián)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)羥基自由基氧化修飾蛋白三維構(gòu)象［18］，影響其凝膠性能［11-12］。在我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)這種氧化促進(jìn)蛋白分子交聯(lián)，影響所成膜的機械性和浸出行為［19］，但對所成膜其他功能性質(zhì)(比如:顏色、透明性、溶解性)的影響還不清楚。

為此，研究采用先加熱后氧化(加熱→氧化)以及先氧化后加熱(氧化→加熱)2種模式分別模擬羥基自由基交聯(lián)蛋白以及氧化蛋白制備過程，同時結(jié)合不同加熱溫度以及pH處理，研究氧化對乳清蛋白所成膜的光學(xué)和水化性質(zhì)2個重要功能的影響，以加深對膜功能性改造的科學(xué)理論認(rèn)識以及為改造后膜的實際應(yīng)用提供技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白(WPI-90)，美國 Hilmar公司;SDSPAGE實驗所需試劑，美國Fisher Scientific公司;所有的化學(xué)試劑均為分析純。

恒溫恒濕箱，美國Parameter Generation＆Control公司;KT5-230-65千分尺，新加坡Kenta Technologies;UV紫外分光光度計，日本島津;色差儀Hunter Lab MiniScan XE plus(Mode-0/45，D65 鈉燈)，美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清蛋白氧化的制備

準(zhǔn)備60 g/L乳清分離蛋白水溶液，pH值調(diào)節(jié)到8或保持原始的值(pH 6.8);70～90℃水浴加熱30 min，冰塊冷卻到室溫(22℃)，然后采用羥基自由基氧化體系(含有0.1 mmol/L FeCl3+1 mmol/L抗壞血酸+0～20 mmol/L H2O2)在室溫下氧化2 h，之后加入最終濃度為1 mmol/L Trolox終止反應(yīng)，即為先加熱后氧化模式(加熱→氧化);調(diào)節(jié)加熱和氧化先后順序，則是先氧化后加熱模式(氧化→加熱)，具體加熱、氧化參數(shù)設(shè)置不變。所制備樣品置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白膜的制備

將上述氧化、加熱蛋白溶液加入24 g/L的甘油，充分?jǐn)嚢瑁?0 mL溶液均勻涂抹在10 cm×10 cm有機玻璃板上，置于23℃、RH 50±2%恒溫恒濕箱中;測定膜功能性前，樣品在箱內(nèi)至少平衡24 h。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用濃度分別為5%濃縮膠和15%分離膠的還原(加入5% β-巰基乙醇作為還原劑，β-ME)和非還原SDS-PAGE方法來測定蛋白交聯(lián)［20］。標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量大小(MW)采用6.5 kDa到200 kDa間的標(biāo)記物來定性。

1.2.4 厚度測定

千分尺隨機測定膜上的10個位置，其平均值則為膜的厚度。

1.2.5 顏色和透明性測定

對同一類型處理蛋白膜至少進(jìn)行3次掃描;標(biāo)準(zhǔn)白板(L＇=92.42，a＇=-0.95，b＇=0.85)對儀器背景值進(jìn)行校準(zhǔn)，測定膜的L，a和b值。用600 nm處膜材料的吸光度A600與膜厚度(mm)的比值來表示蛋白膜的透明性。

1.2.6 蛋白膜溶解度測定

將膜切成1 cm×2 cm大小，加入5.0 mL去離子水，室溫下放置搖床上搖動24 h;采用雙縮脲試劑測定溶液里蛋白含量。蛋白膜溶解度表示為溶出的蛋白占膜總蛋白含量比例(單位:%)。

1.2.7 浸出蛋白質(zhì)組分測定

在室溫下將2.0 cm×2.4 cm大小的膜浸在50 mmol/L Mc’Ilvaine(pH 3 ～7)緩沖液中浸泡 24 h，采用SDS-PAGE方法測定上清液組分分子質(zhì)量。分離膠的濃度采用12.5%，其他測定參數(shù)設(shè)置同1.2.3。

1.2.8 微觀結(jié)構(gòu)測定

采用掃描電鏡(Model S-3400N，日立，日本東京)對所成膜材料的表面進(jìn)行觀察。使用鋒利刀片把膜切成小片，然后對膜樣品進(jìn)行噴金處理;電鏡的加速電壓為10 kV，觀察表面的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化對蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

蛋白溶液在成膜前一系列的處理會對最終膜的性質(zhì)影響有重要的決定性作用。為了考察不同溫度(70～90℃)、氧化濃度(0～20 mmol/L H2O2)以及它們先后順序?qū)Φ鞍踪|(zhì)交聯(lián)行為的影響，采用SDSPAGE對pH 6.8的樣品進(jìn)行蛋白分離。圖1顯示了2種加熱、氧化模式，對分離出的蛋白條帶經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量條帶比對計算，可確定有牛血清白蛋白(BSA)，單體 αLa和 βLg及其二、三聚體(βLg dimer/trimer)和它們之間交聯(lián)物(βLg-αLa)。對于先加熱后氧化處理的樣品，發(fā)現(xiàn)溫度越高對交聯(lián)貢獻(xiàn)越大;在同樣溫度下，不同氧化濃度處理樣品間則無明顯差異。這可能是蛋白在空氣中加熱已發(fā)生氧化而致使羥基自由基后續(xù)氧化對交聯(lián)無顯著提高作用。在還原條件下，大部分聚集物被還原，但βLg的二聚物隨著氧化濃度越高條帶變得越濃。這意味著聚集物除了二硫鍵外，還有其他非還原性的化學(xué)鍵產(chǎn)生，比如羰基氨和雙酪氨酸［13］。對于先氧化后加熱處理的樣品在非還原條件下，70～90℃ 加熱促進(jìn)βLg、αLa二聚物隨著氧化濃度越高而含量越多，高聚物的量也同時增多，而不同加熱溫度間對二聚物含量增加沒有顯著效應(yīng);也就說是，單體βLg、αLa對氧化比對加熱更敏感，導(dǎo)致二聚物抑制加熱對其進(jìn)一步交聯(lián)。類似的現(xiàn)象在前期工作中將樣品pH調(diào)至到8.0后也被觀察到［19］。

2.2 氧化對乳清蛋白膜感光特性的影響

2.2.1 乳清蛋白膜顏色

由表1可以看出，對于先加熱后氧化處理的乳清蛋白所制備的膜，總體趨勢上是白度L值隨著氧化濃度升高而增大，尤其是在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L顯著高于對照組(P＜0.05)，而綠度a值(負(fù)值)特別是黃度b值(正值)在H2O2濃度為5 mmol/L時就顯著降低(P＜0.05)。對于先氧化后加熱處理的樣品所制備的膜，白度L值和綠度a值與前者有類似的規(guī)律，而對于黃度b值在H2O2濃度超過10 mmol/L時，其值有正值變成負(fù)值，也就說是這種序列氧化加熱方式能夠降低膜的黃度并且向藍(lán)度轉(zhuǎn)變?？傊?，氧化提高了蛋白膜的白度和綠度，降低黃度以及提高藍(lán)度(對先氧化后加熱樣品而言)。這些顏色上的變化，可能與模擬氧化體系中加入的鐵離子相關(guān)，與二價、三價鐵離子有關(guān)，在氧化、還原劑的作用下可相互轉(zhuǎn)化造成膜顏色的變化。在作為食品包裝膜材料，要考慮到對食品顏色的影響及進(jìn)一步影響消費者偏好。

圖1 序列氧化和加熱處理乳清蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of sequential heating and oxidation or vice versa treated whey proteins

表1 氧化劑H2O2濃度對乳清蛋白膜顏色的影響Table 1 Effect of oxidant H2O2 concentration on the color of whey protein films

2.2.2 乳清蛋白質(zhì)透明性

相比顏色對于膜材料的重要性，透明性也是評價膜質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，因為這也直接影響消費者對最終包裝食品的選擇。由表2可以看出，經(jīng)先加熱后氧化(在pH 6.8下)處理的乳清蛋白制備膜的透明性能先降低，特別在0.5 mmol/L H2O2達(dá)到最低然后又隨著氧化濃度上升而透明性增加;而H2O2在pH 8.0下對膜的透明性不及pH 6.8下影響大。對于先氧化后加熱所制備的乳清蛋白膜，在pH 6.8下氧化劑 H2O2對膜透明性沒有顯著性影響(P＞0.05)，而在pH 8.0下H2O2則降低膜的透明性。此外，對于同一氧化濃度，無論加熱和氧化順序，較高pH值則能提高膜的透明性，這是因為pH值的提高有利于乳清蛋白帶有更多負(fù)電荷(遠(yuǎn)離等電點緣故)而促使蛋白分子間排斥，使蛋白均勻分散開而提高透明性。

表2 氧化劑H2O2濃度和pH值對乳清蛋白膜透明性的影響Table 2 Effects of oxidant H2O2 concentration and pH on the transparency of whey protein films

2.3 氧化對乳清蛋白膜溶解度的影響

考察蛋白基質(zhì)材料的親、疏水性是為其在實際食品體系中應(yīng)用中提供一個重要參考。為此，采用溶解度來表征乳清蛋白膜的水化性能。未經(jīng)任何處理的乳清蛋白膜通常有較低的溶解性，而乳清蛋白原料經(jīng)過處理制備的膜溶解性會有較大的變化。由圖2-A可以看出，不同加熱溫度，特別是較高溫度90℃相比較低溫度(70℃和80℃)對膜有較低的溶解度，這與乳清蛋白分子在加熱下結(jié)構(gòu)展開致使更多相互作用力(比如疏水性基團間的作用力)而降低膜的溶解性。然而隨著H2O2濃度的提高至5 mmol/L以上，乳清蛋白膜的溶解度顯著上升。氧化因素比溫度因素對膜的溶解性影響更大。從圖2-B中(即先氧化后加熱處理的樣品)亦可以發(fā)現(xiàn)與先加熱后氧化制備的乳清蛋白膜的溶解性有類似的規(guī)律。從分子水平上來看，溶解性的變化可能與在氧化過程中蛋白分子中疏水性氨基酸遭到破壞有關(guān)。事實上，在前期研究中發(fā)現(xiàn) Met、Leu 及 Lys在氧化作用下?lián)p失較大［19］，即驗證了羥基自由基通過氧化疏水性氨基酸而提高膜的溶解性。這給了我們一個重要啟示，氧化處理可有效改變膜的溶解性。

圖2 氧化劑H2O2濃度和成膜加熱溫度對乳清蛋白膜溶解度的影響Fig.2 Effects of oxidant H2O2 concentration and heating temperature on the solubility of whey protein films

2.4 氧化對乳清蛋白膜蛋白浸出性的影響

對經(jīng)歷90℃加熱再對經(jīng)歷5 mmol/L H2O2氧化處理的乳清蛋白制備膜的蛋白浸出成分進(jìn)行分析，一方面可反映膜蛋白分子間的作用力及膜的結(jié)構(gòu)，另外一方面可為膜在不同pH值食品體系中的應(yīng)用提供依據(jù)。從圖3可以看出，相同pH條件下，未經(jīng)氧化的樣品所成的蛋白膜蛋白浸出量顯著低于5 mmol/L H2O2處理的乳清蛋白膜。對照組(即蛋白未氧化)與處理組(即經(jīng)歷5 mmol/L H2O2氧化)在pH 3～7下膜蛋白浸出規(guī)律類似，僅是蛋白浸出量不同。具體表現(xiàn)如下:在非還原條件下，樣品在pH 3處有少量蛋白浸出，在pH 6和pH 7處蛋白浸出量則顯著提高，而在pH 4和pH 5處僅有極少量蛋白出現(xiàn);對浸出蛋白組分分子大小而言，在pH 6和pH 7處除了少量的bLg的二聚物及其三聚物，還有較大量的高聚物(處理組)，結(jié)合還原試驗可知這些聚合物大部分是由還原性二硫鍵交聯(lián)而成，也含有少量非還原性共價。至于樣品在pH 4和pH 5處浸出率極少，這與乳清蛋白等電點(主要成分 βLg等電點為4.5)［21］相關(guān)，進(jìn)而使膜蛋白浸出量受到抑制。

對應(yīng)地是經(jīng)歷90℃加熱再經(jīng)不同濃度氧化劑H2O2處理生產(chǎn)的乳清蛋白膜在pH 6緩沖液下浸出電泳圖，結(jié)果見圖4。從非還原膠上可以看出(見圖4-A)，在pH 6溶液中的浸出蛋白量隨著H2O2濃度上升而顯著增加，特別是氧化劑H2O2濃度在5 mmol/L以上，有大量的高聚物浸出。對照還原電泳實驗(見圖4-B)，說明這些蛋白浸出物除了大部分是由二硫鍵組成，還有部分由非還原性共價鍵交聯(lián)，而后者這些非還原性共價鍵主要交聯(lián)αLa單體和βLg單體形成它們單體的二(三)聚物及αLa/βLg，這與圖1結(jié)果也相互驗證。

圖3 經(jīng)先加熱后氧化處理所成乳清蛋白膜在不同pH緩沖液中蛋白浸出物的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of leached-out proteins from whey protein films(in pH 3 to pH 7 solutions)prepared with heating then oxidation

圖4 經(jīng)先加熱后不同濃度氧化劑量氧化所成膜在pH 6緩沖液中蛋白浸出物的電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of leached-out proteins from the films prepared with heated then oxidized whey proteins.Leaching was done at pH 6

蛋白浸出性能一方面是由于其經(jīng)歷加熱，特別是氧化修飾而改變蛋白結(jié)構(gòu)從而引起親水性能的變化;另外一方面，加熱和氧化因素也會導(dǎo)致蛋白所成膜微觀結(jié)構(gòu)的變化。從pH 8.0條件下制備乳清蛋白膜微觀結(jié)構(gòu)圖(圖5)可以看出，先加熱(90℃)后氧化蛋白所成膜的微孔數(shù)量和孔徑大小會隨著氧化濃度的上升(B:1 mmol/L H2O2→C:10 mmol/L H2O2)而明顯增多和增大(圖5-B、圖5-C)。相比之下，先氧化后加熱蛋白所成膜(D:1 mmol/L H2O2→E:10 mmol/L H2O2)的微孔數(shù)目和大小不及前者數(shù)量多和孔徑大。這些微孔的存在極有可能與蛋白溶解度相關(guān)。與膜溶解性數(shù)據(jù)(圖2)對照，可見微孔數(shù)目和大小與溶解度正相關(guān)，至于膜的橫截面結(jié)構(gòu)特征對溶解度的影響也有類似的結(jié)果［19］;也就是說，微觀結(jié)構(gòu)形貌學(xué)特征解釋了膜材料水化性能的變化，即羥基自由基氧化蛋白最終修飾其所成膜的水化功能性。

圖5 WPI經(jīng)過先氧化后加熱以及先加熱后氧化處理所制備膜的表面掃描電鏡圖Fig.5 SEM surface images of the films prepared from the sequential heating and oxidation or vice versa treated whey proteins

3 結(jié)論

氧化可作為交聯(lián)手段修飾乳清蛋白重要手段，對其具有共價交聯(lián)作用。氧化乳清蛋白不利于發(fā)生熱誘導(dǎo)交聯(lián)，但能夠提高所生產(chǎn)膜的白度和綠度、降低黃度以及降低膜的透明性，通過修飾蛋白疏水性及所成膜的多孔性來控制膜材料的水化性能，較高pH值和溫度均能夠提高膜的透明性、降低膜的水溶解性。此外，先加熱后氧化方式處理還能夠促進(jìn)膜在不同pH下(pI除外)的浸出率，在5 mmol/L H2O2以上浸出率顯著上升。因此，可通過調(diào)節(jié)氧化程度、pH值及加熱溫度以使膜功能具有多功能性以滿足實際食品應(yīng)用體系中對膜功能性的要求。

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