史旭東，王 曉，申一鳴，孫鈺林，梁積新，陳玉清，沈浪濤，＊

1．中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所，北京 102413；2．原子高科股份有限公司，北京 102413

超順磁性氧化鐵納米粒子（SPION）以其較高的生物相容性和優(yōu)良的磁學(xué)性質(zhì)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如靶向藥物載體、核磁共振成像造影劑、磁性細(xì)胞分離、DNA的純化等［1］。以SPION為平臺構(gòu)建將正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET）探針和磁共振（MRI）造影劑相結(jié)合的PET／MRI雙模態(tài)顯像探針是當(dāng)前極具挑戰(zhàn)性的工作。SPION具有較強(qiáng)的可修飾性，可以通過各種手段將發(fā)射正電子的核素、多肽或抗體等靶向分子連接在其上面［2-4］。為了研發(fā)具有腫瘤靶向作用的PET／MRI雙模態(tài)顯像探針，本課題組使用多巴胺和聚乙二醇（PEG）衍生物對SPION進(jìn)行了表面修飾，并在納米粒子表面偶聯(lián)了雙功能螯合劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四羧酸（DOTA）和精氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸環(huán)肽（cyclo（Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys，RGD），獲得了平均粒徑為（57±15）nm的PET／MRI雙模態(tài)顯像探針前體SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD（圖1）［5-6］。近年來，作為優(yōu)良的正電子顯像核素，64Cu（T1／2＝12．7h；β＋：0．653MeV，17．4%；β-：0．578MeV，39%）正受到越來越多的關(guān)注。高比活度的64Cu可通過醫(yī)用加速器生產(chǎn)。64Cu不但用于PET顯像中，也用于放射性治療藥物的研究中。64Cu半衰期較長，可通過DOTA等雙功能螯合劑與靶向生物分子偶聯(lián)［7-9］，適用于耗時(shí)較長的合成操作，非常適合制備過程較為復(fù)雜的雙模態(tài)顯像探針的合成。但目前，磁性納米粒子的64Cu標(biāo)記率不是很高（20%～60%）［10-11］。因此，如何在磁性納米粒子體系中，對64Cu的標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得較高的標(biāo)記率，并選擇適合于放射性納米粒子純化的手段，盡可能提高放化純以滿足體內(nèi)研究的需要是急需解決的問題之一。

圖1 超順磁性氧化鐵納米粒子的結(jié)構(gòu)示意圖［5-6］Fig．1 Structure of SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD［5-6］

鑒于64Cu與雙功能螯合劑DOTA的良好螯合性質(zhì)及與納米材料生物特性的匹配性，本工作擬使用64Cu對超順磁性氧化鐵納米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD進(jìn)行放射性標(biāo)記，并對標(biāo)記、純化條件進(jìn)行摸索，對其體外穩(wěn)定性和脂水分配系數(shù)進(jìn)行測定，還通過該標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)生物分布的研究，揭示其主要的代謝方式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑和儀器

超順磁性氧化鐵納米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD由本實(shí)驗(yàn)室制備［5-6］；64CuCl2，由原子高科股份有限公司提供；快速硅膠簿層層析紙（ITLC-SG），美國Pall公司；PD-10（Sephadex G-25）柱，美國GE公司。人血清白蛋白（HSA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%），上海萊士血液制品股份有限公司；二乙基三胺五乙酸（DTPA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、醋酸銨（CH3COONH4）及其它化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。昆明小鼠15只，雌性，18～20g，北京華阜康生物科技股份有限公司。

1470自動γ計(jì)數(shù)器，美國Perkin Elmer公司；CRC-15放射性活度計(jì)，美國Capintec公司；AR-2000薄層掃描儀，德國Eckert Ziegler公司。

1．2 64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的制備

取100μL SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸銨緩沖溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加 入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，渦旋混勻，反應(yīng)在一定溫度條件下溫育一段時(shí)間。

1．3 標(biāo)記率和放化純的測定方法

標(biāo)記物的標(biāo)記率（Y）及放化純（RCP）均采用快速薄層層析法（ITLC）測定。取2μL反應(yīng)液點(diǎn)樣于ITLC-SG紙（10mm×100mm）上，于10%醋酸銨／甲醇體積比為1∶1的展開體系中上行展開，空氣中自然晾干。用放射性薄層掃描儀進(jìn)行掃描，計(jì)算標(biāo)記率或放化純。在展開體系中，游離的64Cu2＋或64Cu-DTPA隨溶劑移到層析紙前沿，其Rf為0．9～1．0。而標(biāo)記物64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD停留在原點(diǎn)，Rf為0～0．1。

1．4 最佳標(biāo)記條件的選擇

1．4．1 配體濃度對標(biāo)記率的影響 分別取100μL Fe濃度為1．78、3．56、7．12、14．2mmol／L的SPIONdopa-PEG-DOTA／RGD的醋酸銨緩沖溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，渦旋混勻，50℃條件下溫育60min，快速薄層層析法測定標(biāo)記率。

1．4．2 反應(yīng)時(shí)間對標(biāo)記率的影響 取100μL Fe濃度為3．56mmol／L的SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸銨緩沖溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，渦旋混勻，50℃條件下溫育，分別在反應(yīng)40、50、60、70min后取樣監(jiān)測，快速薄層層析法測定標(biāo)記率。

1．4．3 溫度對標(biāo)記率的影響 取100μL Fe濃度為3．56mmol／L的SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD醋酸銨緩沖溶液（pH＝6．5，0．1mol／L）加入2mL EP管中，加入10μL（3．7MBq）64CuCl2，渦旋混勻，分別在40、50、60℃條件下溫育60min，快速薄層層析法測定標(biāo)記率。

1．5 標(biāo)記物64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的純化

取500μL Fe濃度為3．56mmol／L的SPIONdopa-PEG-DOTA／RGD醋酸銨緩沖溶液（pH＝6．5，0．1mol／L），加入2mL EP管中，并加入100μL（18．5MBq）64CuCl2，渦旋混勻，在50℃條件下溫育60min。反應(yīng)結(jié)束后待標(biāo)記反應(yīng)混合液冷卻至室溫，加入100μL 10mmol／L DTPA溶液，室溫下溫育20min，結(jié)合游離的64Cu。

標(biāo)記物均采用PD-10柱排阻純化：將PD-10柱用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0．1mol／L，pH＝7．2）淋洗平衡后，加入反應(yīng)混合物，PBS作為淋洗液，以每管0．5mL收集洗脫液，用活度計(jì)測量每管中的放射性活度。

1．6 標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性考察

PBS體系：取64Cu標(biāo)記的氧化鐵納米粒子約3．7×105Bq，置于200μL PBS中（pH＝7．2），渦旋混勻，37℃條件下，溫育3、6、12h后分別采用快速薄層層析法測定放化純，觀察其體外穩(wěn)定性。

HSA體系：取64Cu標(biāo)記的氧化鐵納米粒子約3．7×105Bq，置于200μL 10%的人血清白蛋白HSA中，渦旋混勻，37℃條件下，溫育3、6、12h后，依次取50μL混合液，加入50μL乙腈，渦旋1min，常溫下5 000r／min下離心10min，取上清液，快速薄層層析法測定放化純，觀察其體外穩(wěn)定性。

1．7 脂水分配系數(shù)的測定

取100μL標(biāo)記物的磷酸鹽緩沖溶液，加入到含3mL正辛醇和3mL磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7．2、0．01mol／L）的10mL離心試管中，蓋好后充分震蕩5min，在離心機(jī)中離心分層5min，轉(zhuǎn)速為4 000r／min。分別取有機(jī)相和水相各500μL于干凈測量管中，在γ計(jì)數(shù)器中分別測量其放射性計(jì)數(shù)，由有機(jī)相和水相的放射性計(jì)數(shù)的比值來計(jì)算脂水分配系數(shù)P，計(jì)算lg P。重復(fù)3次，取平均值。

1．8 標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

取100μL64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的磷酸鹽緩沖溶液，活度約為5．6×105Bq，經(jīng)尾靜脈注射到15只昆明小鼠體內(nèi)，在注射后0．5、1、3、6、12h眼眶取血，處死并進(jìn)行解剖，取心臟、肝臟、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、股骨、血等器官或組織稱重，γ計(jì)數(shù)器上測量其計(jì)數(shù)。經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織的百分注射劑量率（%ID／g）。

2 結(jié)果與討論

2．1 最佳標(biāo)記條件的選擇

通過分別改變反應(yīng)體系的配體用量、反應(yīng)時(shí)間和溫度等因素，確定64Cu-SPION-dopa-PEGDOTA／RGD的最佳標(biāo)記條件。

2．1．1 配體Fe濃度對標(biāo)記率的影響 在反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間60min的條件下，考察配體Fe濃度（c（Fe））對標(biāo)記率的影響，結(jié)果示于圖2（a）。由圖2（a）可知：配體用量對64Cu的標(biāo)記率的影響較大，當(dāng)配體中Fe濃度為1．78mmol／L時(shí)，標(biāo)記率并不理想，僅為34%；當(dāng)配體中Fe濃度增加到3．56mmol／L時(shí)，標(biāo)記率得到了顯著提高，達(dá)到了63%。然而，在繼續(xù)增大配體量時(shí)，標(biāo)記率沒有呈現(xiàn)增大的趨勢，反而出現(xiàn)了大幅的下降。因此，選擇配體的Fe濃度為3．56mmol／L。

2．1．2 反應(yīng)時(shí)間對標(biāo)記率的影響 在配體Fe濃度3．56mmol／L、反應(yīng)溫度50℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對標(biāo)記率的影響，不同反應(yīng)時(shí)間對標(biāo)記率的影響示于圖2（b）。由圖2（b）可知：反應(yīng)時(shí)間的增長有利于標(biāo)記率的提升，50min之后逐漸趨于穩(wěn)定。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為60min。

2．1．3 溫度對標(biāo)記率的影響 在配體Fe濃度3．56mmol／L、反應(yīng)時(shí)間60min條件下，考察反應(yīng)溫度對標(biāo)記率的影響，不同溫度條件下標(biāo)記率的測定結(jié)果示于圖2（c）。根據(jù)文獻(xiàn)［12］，將初始反應(yīng)溫度定在40℃，標(biāo)記率為31%。反應(yīng)溫度提高到50℃時(shí)，標(biāo)記率達(dá)到了63%。由于氧化鐵納米粒子前體的穩(wěn)定性受溫度影響較大，高溫條件下容易發(fā)生團(tuán)聚甚至出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)標(biāo)記率的下降，因此，沒有進(jìn)行更高溫度條件下的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)溫度定在50℃。文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道，納米材料的64Cu標(biāo)記率在20%～60%之間。通過配體Fe濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度對標(biāo)記率的影響研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化條件下，64Cu的標(biāo)記率可提高至63%。雖然，在文獻(xiàn)中未見64Cu標(biāo)記率較低的原因分析，但我們推測，在納米材料體系中不能通過無限制地提高溫度的方式來提高標(biāo)記率，因?yàn)楦街诩{米材料表面的高分子隨溫度升高將脫落，導(dǎo)致團(tuán)聚乃至沉淀現(xiàn)象；此外，由于結(jié)合在納米材料上的螯合基團(tuán)（DOTA）是有限的，并且這些螯合基團(tuán)還可能被PEG覆蓋，處于不利于與64Cu結(jié)合的狀態(tài)，因此，即使提高配體Fe的濃度也不能提高標(biāo)記率。這些因素都可能是導(dǎo)致納米材料體系中64Cu標(biāo)記率不高的原因。

圖2 配體Fe濃度（a）、反應(yīng)時(shí)間（b）、反應(yīng)溫度（c）對標(biāo)記率（Y）的影響Fig．2 Influences of ligand concentration（a），reaction time（b）and reaction temperature（c）on labeling efficiency

2．2 標(biāo)記化合物的純化

標(biāo)記物采用PD-10柱純化。在標(biāo)記反應(yīng)混合溶液中加入過量的DTPA，結(jié)合游離的和非特異結(jié)合在納米材料上的64Cu［13-14］，而64Cu-DTPA與標(biāo)記物64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在PD-10柱中的保留時(shí)間存在明顯差異，通過收集不同時(shí)間點(diǎn)的洗脫液可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物的純化。純化后產(chǎn)物經(jīng)薄層層析法檢測后發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記物基本全部集中在原點(diǎn)（圖3（b）），Rf＝0～0．1。這說明64Cu已成功標(biāo)記至SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD，且放化純大于95%。在本研究的初始階段，參考64Cu標(biāo)記DOTA及其衍生物的條件進(jìn)行標(biāo)記并直接采用排阻色譜進(jìn)行分離，但通過紙色譜最終放化純的分析發(fā)現(xiàn)很難將標(biāo)記物完全分離。在純化過程中沒有加入DTPA，直接將標(biāo)記反應(yīng)混合溶液在PD-10柱上洗脫，但最終的標(biāo)記物放化純（圖3（a））并不理想，只有71%。這說明DTPA對游離銅的螯合作用對于該標(biāo)記物的分離十分重要。DTPA的作用可能與文獻(xiàn)［13-14］的解釋類似，即通過DTPA與PEG的競爭，除去在PEG上非特異結(jié)合的64Cu，使之轉(zhuǎn)化為64Cu-DTPA，從而極大地改善了分離效果。

2．3 標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性考察

放射性藥物必須要有足夠的體外穩(wěn)定性。64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的體外穩(wěn)定性檢測結(jié)果示于圖4。由圖4可知，標(biāo)記物在37℃下溫育，在0．1mol／L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和體積分?jǐn)?shù)為10%的人血清白蛋白（HSA）溶液中均比較穩(wěn)定，放置12h后，放化純（RCP）僅略有下降，但仍大于90%。說明該標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性良好，可以用于進(jìn)一步的體內(nèi)研究。

圖4 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在HSA和PBS中的穩(wěn)定性Fig．4 Stability of 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD in HSA and PBS

2．4 脂水分配系數(shù)的測定

64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD的 脂水分配系數(shù)P為0．054 40，lg P值為-1．27，藥物表現(xiàn)出較高的水溶性，這歸結(jié)于PEG衍生物對納米粒子的表面修飾，從而有助于藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分布，延長其體內(nèi)的循環(huán)半衰期，從而使該探針更有效地作用于靶點(diǎn)。

2．5 標(biāo)記物在正常小鼠中的體內(nèi)分布

正常小鼠體內(nèi)64Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在各器官的生物分布結(jié)果列入表1。由表1可知：放射性標(biāo)記物在肝臟（（8．42±0．32）%ID／g，30min）、脾臟（（3．55±0．51）%ID／g，30min）和腎（（5．99±0．61）%ID／g，30min）中的吸收最高，而其他器官對藥物的攝取相對較低，表明該標(biāo)記物主要通過肝、脾代謝，腎臟排泄，這與粒徑小于100nm的納米粒子在體內(nèi)的生物分布和代謝途徑基本一致［15-16］。體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES，包括肝、脾、肺和骨髓等組織）具有豐富的吞噬細(xì)胞，可將一定大小的納米顆粒作為異物而攝取，較大的顆粒由于不能濾過毛細(xì)血管，而被截留于某些部位。粒徑100～200nm的顆粒很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞從血液中清除，最終到達(dá)kupffer細(xì)胞的溶酶體中；50～100nm的顆?？梢赃M(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而小于50nm的納米粒子則通過淋巴系統(tǒng)傳遞到脾和骨髓中［17］。

表1 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD在正常小鼠體內(nèi)分布Table 1 Biodistribution of 64 Cu-SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD in normal mice

3 結(jié) 論

以超順磁性氧化鐵納米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA／RGD為前體，使用正電子核素64Cu對其進(jìn)行了放射性標(biāo)記。通過改變反應(yīng)體系的配體用量、反應(yīng)時(shí)間和溫度等因素，得到優(yōu)化后的標(biāo)記條件為：配體中Fe濃度為3．56mmol／L，反應(yīng)時(shí)間為60min，反應(yīng)溫度為50℃，經(jīng)優(yōu)化后的標(biāo)記率可達(dá)到63%。通過加入DTPA螯合游離和非特異結(jié)合在納米材料上的64Cu并使用PD-10柱進(jìn)行純化后，得到了放化純大于95%的標(biāo)記物，解決了氧化鐵納米材料64Cu標(biāo)記物不易純化的難題。該標(biāo)記物在12h內(nèi)表現(xiàn)出了較高的體外穩(wěn)定性且具有良好的水溶性。正常小鼠體內(nèi)的生物分布揭示了其主要的代謝方式，該標(biāo)記物可用于后續(xù)的PET／MRI雙模態(tài)顯像的研究。

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