腦損傷大鼠周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征及其PPARα的表達(dá)

肖智勇

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江西吉安343000)

摘要〔〕目的探討實(shí)驗(yàn)性腦損傷模型周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征及其過氧化物酶增殖物激活α受體(PPARα)的表達(dá)。方法采用自由落體硬膜外撞擊法建立大鼠腦損傷模型，免疫組化法檢查周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征，Western印跡檢測大鼠腦組織PPARα 蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測PPARα mRNA表達(dá)。結(jié)果16例肉眼見血腫塊體積較小，顯微鏡下呈大量中性粒細(xì)胞或其他炎癥細(xì)胞浸潤，4例肉眼見血腫塊體積較大，與周圍組織粘連，并呈現(xiàn)條索狀和噴射狀樣，顯微鏡下見炎癥細(xì)胞浸潤，血管空腔結(jié)構(gòu)。模型組PPARα蛋白、mRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，腦損傷后24 h PPARα蛋白、mRNA表達(dá)達(dá)到最高峰，明顯高于腦損傷后2 h和6 h(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長，腦損傷后48 h較24 h的PPARα蛋白、mRNA表達(dá)明顯降低，不同時(shí)段比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論腦損傷后誘發(fā)PPARα表達(dá)增高可能與周圍血腫氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子的異常有關(guān)，且24 h達(dá)到高峰值。

關(guān)鍵詞〔〕腦損傷；血腫；過氧化物酶增殖物激活α受體

中圖分類號〔〕R743〔

第一作者：肖智勇(1972-)，男，碩士，講師，主要從事神經(jīng)外科疾病的臨床治療及基礎(chǔ)研究。

腦損傷容易導(dǎo)致周圍血腫形成、血腦屏障受損和腦部血液供應(yīng)能力下降，造成腦部缺血再灌注損傷，嚴(yán)重影響神經(jīng)功能的恢復(fù)〔1〕。采用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層顯像和正電子發(fā)射斷層掃描等技術(shù)證實(shí)了腦損傷致周圍血腫形成〔2〕。但是，腦損傷致腦部缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確，過氧化物酶增殖物激活α受體(PPARα)主要分布于心、肝、骨骼、動脈粥樣硬化性板塊、血管內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪組織等器官和組織中，具有調(diào)節(jié)脂肪組織、氨基酸代謝，參與脂質(zhì)代謝異常、動脈粥樣硬化和冠心病等多種疾病發(fā)生和發(fā)展的過程中〔3〕。相關(guān)研究顯示，PPARα廣泛性分布于腦組織中，其與神經(jīng)細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激緊密相關(guān)，對腦組織缺血缺氧性再灌注損傷具有潛在的保護(hù)作用〔4〕。但關(guān)于腦損傷致周圍血腫的組織形態(tài)學(xué)特征和腦組織PPARα表達(dá)研究甚少，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1動物與分組選取健康成年雄性SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g)32只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK 2010-0004。隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組16只。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)性腦損傷模型建立模型組采用自由落體硬膜外撞擊法建立大鼠腦損傷模型，采用水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰臥固定大鼠，于頸部正中行3 cm切口，同時(shí)向右側(cè)延伸2 cm，分離兩側(cè)頸總動脈和單側(cè)頸靜脈，頸靜脈近心端夾閉，行“V”形切口，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，插管入右心房，輸注抗凝劑肝素，抽取30%血液，夾閉兩側(cè)頸總動脈，缺血處理20 min，取下兩側(cè)頸總動脈夾，結(jié)扎頸靜脈，縫合頸部正中切口。腦損傷后2、6、12、48 h時(shí)(每個(gè)時(shí)段取4只)取腦，操作過程中由于動物死亡和模型建立失敗導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)量不足，再次通過隨機(jī)抽樣方法重新建立腦損傷大鼠模型，以彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)動物模型的數(shù)量不足現(xiàn)象。假手術(shù)組不作腦損傷，僅在顱骨上行一直徑約4 mm的骨窗。

1.2.2試劑與儀器Biozol RNA 提取劑(Bioflux，BSC51S1)，RNA later(Qiagen，124116951)，PPARα(Abcam 公司)，ReverTra Ace-α-(TOYOBO，F(xiàn)SK-100，65890M4)，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce，China)，BCA 法蛋白定量試劑盒(申能博彩，中國)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)，PCR擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR-2400)，高速冷凍離心機(jī)(Heraeus Labofuge 400)。

1.2.3周圍血腫形態(tài)組織學(xué)檢查制備周圍血腫組織學(xué)載玻片，腦損傷大鼠缺血處理前收集血腫組織，經(jīng)血腫剝離后放置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，獲取切片厚度約為4 μm，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征。

1.2.4PPARα 蛋白表達(dá)采用Western印跡檢測大鼠腦組織PPARα蛋白表達(dá)，提取腦組織蛋白，采用BCA法測定腦組織蛋白，加入緩沖液，加熱變性，加膜，常溫下封閉1 h，洗膜10 min×3次，加入PPARα抗體，4℃冰凍箱過夜，洗膜10 min×3次，加入標(biāo)志物抗體，常溫下孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑處理，成像系統(tǒng)分析并檢測β-actin與PPARα的光密度值。

1.2.5RT-PCR檢測PPARα mRNA表達(dá)取腦部海馬組織50～100 mg，加入1 ml Biozol RNA 提取劑和0.2 ml氯仿，提取總RNA，取其中5 ml檢測RNA濃度和純度。采用RT-PCR試劑盒合成cDNA，采用PCR擴(kuò)增儀行PCR擴(kuò)增，其中cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)體系(RT緩沖液4 μl×5、10 mmol/L dNTP 2 μl、10 U/μl RNase 1 μl、10 pmol/μl Oligo 1 μl、模板RNA 1 μg、ReverTra Ace-α1 μl、RNase Free H2O 10 μl)，反應(yīng)條件：30℃ 10 min、42℃ 20 min、 99℃ 5 min、4℃ 5 min。PCR循環(huán)參數(shù)為 94℃ 4 min，94℃ 15 s，55.2℃ 15 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PPARα引物序列：正義5′-ACGATGCTGTCCTCCTTGATG-3′；反義5′-GCGTCTGACTCGGTCTTCTTG-3′；β-actin引物序列：正義5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；反義5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠(經(jīng)溴乙啶染色)電泳，采用成像系統(tǒng)分析并檢測β-actin與PPARα的光密度值。

2結(jié)果

2.1周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征16只腦損傷周圍血腫形成大鼠中，其中肉眼見血腫塊體積較小，顯微鏡下呈大量中性粒細(xì)胞或其他炎癥細(xì)胞浸潤，占75%(12/16)。肉眼見血腫塊體積較大，與周圍組織粘連，并呈現(xiàn)條索狀和噴射狀樣，顯微鏡下見少量炎癥細(xì)胞浸潤，出血血管豐富，可見血管空腔結(jié)構(gòu)，占25%(4/16)。

2.2兩組PPARα蛋白、mRNA表達(dá)比較模型組PPARα蛋白(0.81±0.09)、mRNA表達(dá)(0.79±0.07)均明顯高于假手術(shù)組(0.45±0.07,0.46±0.08)(P<0.05)。

2.3實(shí)驗(yàn)性腦損傷模型不同時(shí)間點(diǎn)PPARα蛋白、mRNA表達(dá)比較腦損傷后24 h PPARα蛋白、mRNA表達(dá)達(dá)到最高峰，明顯高于腦損傷后2 h和6 h(P<0.05)，腦損傷后24 h隨著時(shí)間的延長，PPARα蛋白、mRNA表達(dá)明顯降低，腦損傷后48 h明顯低于24 h(P<0.05)，見表1。

組別蛋白mRNA2h0.56±0.080.58±0.076h0.63±0.070.68±0.0924h0.96±0.071)0.99±0.081)48h0.76±0.080.73±0.07

與其他時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.05

3討論

隨著人口老齡化的加重，高血壓性腦出血發(fā)生率和致死率逐年上升，該類患者于腦動脈破裂、出血并形成周圍血腫〔5〕。據(jù)相關(guān)研究顯示，老年高血壓出血性疾病是造成腦損傷的重要原因。入院后應(yīng)警惕血腫擴(kuò)大的形成，以降低腦水腫、腦積水等臨床不良事件的發(fā)生，降低患者病死率〔6〕。腦損傷后血腫體積增大與血壓、血腫形態(tài)具有明顯的相關(guān)性。大量研究證實(shí)，腦損傷后血腫擴(kuò)大與收縮壓具有緊密相關(guān)性，而與舒張壓無關(guān)，對于收縮壓大于20 mmHg時(shí)應(yīng)及時(shí)采用控制血壓治療〔7〕。但是，關(guān)于腦損傷后血腫體積與周圍血腫組織形態(tài)學(xué)特征的關(guān)系研究較少。另一方面，PPARα在提示腦損傷合適治療時(shí)間窗和改善預(yù)后中具有重要的價(jià)值，周圍腦組織PPARα具有調(diào)節(jié)乙酰輔酶、Cu-Zn SOD，PPARα與神經(jīng)退行性病變、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子表達(dá)相關(guān)〔8〕。PPARα被激活后具有降低腦內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和蛋白激酶(PKC)eNOS和PKC在腦損傷后局部腦缺氧缺血病灶中發(fā)生異常改變〔9〕。對無PPARα受體腦損傷動物模型的影像學(xué)檢查監(jiān)測的研究中發(fā)現(xiàn)，PPARα具有重要的神經(jīng)保護(hù)功能，促PPARα興奮藥物具有降低腦缺血缺氧性病灶的形成〔10〕。因此，PPARα對腦損傷后腦缺氧缺血性病變具有重要的神經(jīng)保護(hù)功能，在腦損傷的治療中具有重要的價(jià)值。促PPARα興奮藥物對腦保護(hù)作用有賴于PPARα表達(dá)程度的高低，因此，觀察實(shí)驗(yàn)性腦損傷模型周圍血腫形態(tài)組織學(xué)特征及其PPARα表達(dá)變化可能對老年高血壓腦出血致腦損傷的診治中具有重要的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，顯微鏡下周圍血腫呈不同程度的炎癥因子浸潤，其中肉眼見血腫體積較小的炎癥細(xì)胞浸潤程度越明顯，反之，肉眼見血腫體積較大的可見豐富的血管腔，可能導(dǎo)致顱腦血管腔內(nèi)繼續(xù)出血和腦損傷預(yù)后不良的原因。因此，腦損傷后常合并不同的氧化應(yīng)激性和炎癥因子的異常改變。另外PPARα蛋白、mRNA表達(dá)的增加可能與周圍血腫致炎癥因子形成有關(guān)。另一方面，周圍血腫形成容易導(dǎo)致腦水腫、腦積水等顱內(nèi)壓的異常增高表現(xiàn)，在一定程度出現(xiàn)神經(jīng)壓迫癥狀，容易導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失和預(yù)后狀況欠佳〔11〕。但也有研究表明，促PPARα興奮藥物對腦損傷致缺血再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用，腦損傷后PPARα表達(dá)水平的增加降低了腦缺血再灌注損傷程度，在24 h PPARα表達(dá)高峰值中給予促PPARα興奮藥物的效果最佳〔12〕，但有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)性研究。

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〔2013-11-01修回〕

(編輯李相軍)