柿葉黃酮對ApoE缺失小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

陳英珠白衛(wèi)娜時瑋吳萌

(河北省科學院生物研究所，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的觀察柿葉黃酮對頭臂干動脈粥樣硬化斑塊(AS)穩(wěn)定性的影響。方法高脂飼料飼喂的載脂蛋白(Apo)E-/-缺失小鼠，灌胃給予柿葉總黃酮，觀察其對頭臂干AS斑塊形成和穩(wěn)定性的影響。檢測血清血脂含量和斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積。結(jié)果柿葉總黃酮連續(xù)灌胃12 w，與模型組比較，柿葉黃酮組AS斑塊面積與管腔面積比從34%降低至14%；斑塊內(nèi)包埋的纖維帽數(shù)量減少71%；MMP-9陽性染色明顯減少。油紅O染色面積減少53%。對血脂無顯著影響。結(jié)論柿葉總黃酮顯著降低頭臂干AS的形成，可能減少不穩(wěn)定性斑塊形成和血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積。

關(guān)鍵詞〔〕柿葉黃酮；動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性；斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積

中圖分類號〔〕R2〔

第一作者：陳英珠(1962-)，女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理學研究。

研究表明柿葉黃酮抑制動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成〔1，2〕，但AS對斑塊穩(wěn)定性的影響尚不是十分清楚。本文以載脂蛋白E缺失(ApoE-/-)小鼠為材料，研究柿葉黃酮對頭臂干AS斑塊穩(wěn)定性的影響。

1材料和方法

1.1材料ApoE-/-小鼠購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，高脂飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(含21%豬油和0.15%膽固醇)。MMP-9購自Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒為中杉產(chǎn)品。辛伐他汀由汕頭金石制藥總廠生產(chǎn)。柿葉黃酮有本研究室自制，純度≥25%，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗分組實驗分為3組：模型組、柿葉黃酮組和辛伐他汀組(對照組)。8 w的雄性ApoE-/-小鼠60只，每組20只，自由飲水，飼喂高脂飼料。治療組和辛伐他汀組分別灌胃給予30 mg·kg-1·d-1體重柿葉黃酮和辛伐他汀，模型組灌胃給予生理鹽水。

1.3病理學觀察連續(xù)灌胃12 w后，小鼠經(jīng)麻醉后采血、處死，取頭臂干動脈血管，生理鹽水清洗管腔，OCT包埋，冰凍切片，連續(xù)橫切，片厚8 μm,HE染色或油紅O染色。普通OLYMPUS光學顯微鏡觀察并采集圖像。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)對血管腔面積和動脈粥樣硬化總面積及油紅O染色面積進行相對定量分析。

1.4血脂測定連續(xù)灌胃12 w后，小鼠經(jīng)麻醉后采血，分離血清。按常規(guī)方法，應用日立-7170全自動生化儀測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。

1.5彈力纖維染色采用間苯二酚-堿性品紅染色法(Hart氏改良法)。

1.6免疫組化常規(guī)方法進行。MMP-9抗體濃度1∶400。結(jié)果采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)進行灰度值測定：灰度值越大，表明陽性染色顆粒表達越少，反之，表達越多。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1柿葉黃酮對AS斑塊形成的影響與模型組相比，服用柿葉黃酮后，斑塊面積與空腔面積比由0.34降至0.14(P<0.05),與辛伐他汀組相比，兩者之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

組別管腔面積(μm2)斑塊面積(μm2)斑塊面積/管腔面積模型組39137.88±2719.5513329.95±3079.070.33±0.07柿葉黃酮組38580.37±3014.445360.79±1948.160.12±0.021)辛伐他汀組41314.54±2717.385959.47±2516.880.14±0.041)

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.2柿葉黃酮對AS斑塊內(nèi)包埋的纖維帽數(shù)量的影響喂高脂飼料12 w。與模型組比較，柿葉黃酮組及辛伐他汀組AS斑塊內(nèi)包埋的開維帽數(shù)量明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

組別油紅染色面積(μm2)包埋纖維帽數(shù)MMP-9模型組13709.08±2765.140.42±0.15137.79±14.92柿葉黃酮組6485.66±3072.071)0.10±0.061)155.34±10.671)辛伐他汀組6689.85±3095.951)0.15±0.111)156.76±12.481)

2.3柿葉黃酮對MMP-9表達的影響高脂飼料喂飼12 w時，模型組MMP-9表達量顯著高于柿葉黃酮組和辛伐他汀組(P<0.05)。見表2。

2.4柿葉黃酮對血清血脂變化的影響飼喂高脂飼料12 w，與模型組比較，柿葉黃酮組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL各指標之間均無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.5柿葉黃酮對頭臂干血管壁脂質(zhì)沉積的影響油紅O染色顯示頭臂干血管壁脂質(zhì)沉積情況。喂高脂飼料飼12 w，與模型組相比，柿葉黃酮組油紅O染色面積減少53%(P<0.05)。

組別TCTGLDLHDL模型組20.89±4.021.82±0.2819.21±3.410.66±0.09柿葉黃酮組20.39±6.911.86±0.5119.45±6.010.68±0.25辛伐他汀組20.16±5.011.64±0.4518.93±4180.65±0.19

3討論

近年來研究表明，喂高脂飼料飼的ApoE-/-小鼠飼喂早期頭臂干內(nèi)發(fā)生急性斑塊坍塌，隨后，斑塊內(nèi)形成包埋的纖維帽〔3〕。且他汀類藥物有減少高脂飼料飼喂的ApoE-/-小鼠急性斑塊坍塌的作用。本研究結(jié)果提示柿葉黃酮顯著降低頭臂干中AS斑塊形成，顯著減少急性斑塊坍塌。

斑塊穩(wěn)定性與多種因素相關(guān)，過度表達的MMP-9通過降解細胞外基質(zhì),導致纖維帽變薄，形成不穩(wěn)定斑塊。脂質(zhì)核心的大小和硬度對斑塊的穩(wěn)定性起重要作用〔4，5〕。本實驗MMP-9免疫組化統(tǒng)計結(jié)果顯示，柿葉黃酮顯著降低斑塊內(nèi) MMP-9的表達。雖然柿葉黃酮對血清中脂質(zhì)無顯著影響，但是，它明顯降低血管壁中脂質(zhì)沉積。這些可能是柿葉黃酮維持斑塊穩(wěn)定性的因素。

4參考文獻

1歐陽平,貝偉劍,賴文巖,等.柿葉黃酮抑制LDL刺激的大鼠血管平滑肌細胞增殖〔J〕.中藥材，2004；27(8):600-2.

2陳英珠，白衛(wèi)娜，吳萌，等.柿葉黃酮對載脂蛋白E缺失小鼠動脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(12)：2233-4.

3Jason Johnson,Kevin Carson,Helen Williams,etal.Plaque rupture after short periods of fat feeding in the apolipoprotein E-knockout mouse:model characterization and effects of pravastatin treatment〔J〕.Circulation,2005;111(11):1422-30.

4Brown DL,Hibbs MS,Kearney M,etal.Identification of 92-kD gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions:association of active enzyme synthesis with unstable angina 〔J〕.Circulation,1995;91(8):2125-31.

5Libby P,Maikawa M.New insights into plaque stablization by lipid lowering 〔J〕.Drugs,1998;56(Suppl 1):9-13.

〔2013-03-13修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)