姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中NDRG2基因表達(dá)的影響

李照偉柳長明1何其勇1趙東慧2姜吉洵2

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討姜黃素對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株中N-myc F下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)2表達(dá)的影響及姜黃素不同濃度處理下NDRG2基因表達(dá)情況。方法應(yīng)用不同濃度的姜黃素干預(yù)體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞48 h后，提取總RNA，并運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測姜黃素對(duì)HT-29細(xì)胞中NDRG2基因表達(dá)的影響。利用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，運(yùn)用Western印跡技術(shù)，檢測姜黃素對(duì)HT-29細(xì)胞中NDRG2蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。結(jié)果姜黃素不但能夠在mRNA水平促進(jìn)HT-29細(xì)胞中NDRG2基因的表達(dá)，且能夠促進(jìn)NDRG2蛋白質(zhì)的表達(dá)，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但有效濃度范圍在20～100 μmol/L，且80 μmol/L效果最佳，表明姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)NDRG2基因上調(diào) (P<0.05)，RG2基因，并能有效抑制腫瘤細(xì)胞。結(jié)論姜黃素能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞中NDRG2基因和蛋白的表達(dá)，且具有劑量依賴性，最佳濃度為80 μmol/L。

關(guān)鍵詞〔〕結(jié)腸癌；HT-29；NDRG2基因；姜黃素

中圖分類號(hào)〔〕R73〔

通訊作者：柳長明(1969-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腸道腫瘤研究。

1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2佳木斯市中心醫(yī)院

第一作者：李照偉(1982-)，男，碩士，主要從事腸道腫瘤研究。

N-myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因家族，主要是由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成〔1〕。前期的研究發(fā)現(xiàn)NDRG2的表達(dá)量與細(xì)胞的分化呈正相關(guān)，和增殖能力呈負(fù)相關(guān)〔2〕。姜黃素是從姜科、天南星科中一些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，可以增強(qiáng)抗腫瘤藥物塞來昔布的藥效〔3〕。本研究主要探討不同濃度梯度姜黃素的干預(yù)下結(jié)腸癌組織中NDRG2基因的表達(dá)。

1材料與方法

1.1材料選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29)作為體外模型，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；姜黃素粉劑購自成都普非德生物有限公司。

1.2主要儀器微量注射器(10～1 000 μl)EPPENdORF公司產(chǎn)品;圖像采集顯微鏡，BX50，日本OLYMPUS公司；Mini垂直電泳儀，Bio-Rad，昆士蘭生物(Queensland)公司：PCR儀RR014A，日本TAKARA公司。

1.3HT-29細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、種板姜黃素溶解于二甲基亞砜配制成的100 mmol/L的儲(chǔ)存液，配置終濃度分別為20、40、80、100 μmol/L，滴入6孔培養(yǎng)板中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4RT-PCR應(yīng)用不同濃度的姜黃素干預(yù)體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞48 h后，提取總RNA,引物設(shè)計(jì)、反轉(zhuǎn)錄得到cDNA做模板，再行RT-PCR檢測NDRG2 mRNA表達(dá)水平。

1.5Western印跡利用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離蛋白，再通過電濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚氟偏乙烯(PVDF)膜，利用NDRG2蛋白抗體檢測姜黃素對(duì)HT-29細(xì)胞中NDRG2蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0 軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。

2結(jié)果

2.1姜黃素促進(jìn)HT-29細(xì)胞中NDRG2基因mRNA表達(dá)姜黃素對(duì)HT-29細(xì)胞中NDRG2基因表達(dá)有促進(jìn)作用，且NDRG2 mRNA表達(dá)量的增加與姜黃素濃度呈劑量依賴性關(guān)系，NDRG2 mRNA表達(dá)量隨姜黃素濃度的增加而上調(diào)；且80 μmol/L濃度時(shí)，NDRG2增加量最明顯；當(dāng)姜黃素濃度繼續(xù)增加時(shí)，對(duì)NDRG2 mRNA的表達(dá)促進(jìn)作用反而有所減弱。60、80 μmol/L姜黃素組與 0、20 μmol/L姜黃素處理組相比，NDRG2基因的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，但當(dāng)姜黃素濃度增加到100 μmol/L時(shí)， NDRG2 mRNA的表達(dá)并沒有隨濃度增加而繼續(xù)增加，反而有所下降，但與陰性對(duì)照組相比仍差異顯著(P<0.05)。見圖1。

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下圖同 圖1　姜黃素處理48 h后NDGR2 mRNA表達(dá)水平變化

圖2　姜黃素處理48 h后HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中 NDGR2蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

2.2姜黃素促進(jìn)HT-29細(xì)胞中NDRG2蛋白質(zhì)的表達(dá)圖2可見，DRG2蛋白表達(dá)量隨姜黃素濃度的增加而上調(diào)，且當(dāng)姜黃素濃度為60或80 μmol/L時(shí)，NDRG2蛋白表達(dá)量增加最明顯，當(dāng)姜黃素濃度繼續(xù)增加時(shí)，對(duì)NDRG2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用反而有所減弱(圖2A)。當(dāng)用20、40 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，NDRG2蛋白的增加較顯著；而用60、80 μmol/L姜黃素處理HT-29細(xì)胞時(shí)， 與陰性對(duì)照組相比，NDRG2蛋白的表達(dá)增加更明顯(P<0.01)，但當(dāng)姜黃素濃度增加到100 μmol/L時(shí)， NDRG2蛋白表達(dá)量并沒有隨濃度增加而繼續(xù)增加，反而有所下降，但與陰性對(duì)照組相比差異仍比較顯著(P<0.05)。

3討論

癌基因的激活與抑癌基因的失活參與癌的發(fā)生、發(fā)展，針對(duì)其二者的治療也越來越多。 在目前所有的腫瘤基因治療計(jì)劃中,免疫基因治療占40%。也有用藥物敏感基因即自殺基因治療,還有腫瘤抑制基因治療,以及用多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染到患者造血干細(xì)胞以增強(qiáng)患者對(duì)化療的耐受性等〔4〕。有人在結(jié)腸癌細(xì)胞株中導(dǎo)入抗癌基因,其生長就受到不同程度的抑制,如果SW480細(xì)胞株缺失或突變的是P53基因,導(dǎo)入野生型P53即發(fā)現(xiàn)腫瘤明顯消退〔5〕。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，通過原位雜交和免疫組化方法證實(shí),姜黃素處理細(xì)胞后,c-myc基因 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低,說明 c-myc 基因表達(dá)水平降低與姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其具體機(jī)制可能與Caspase-3 的表達(dá)增加引起細(xì)胞內(nèi)的凋亡有重大關(guān)系。同時(shí)，相關(guān)研究人員利用反義表達(dá)載體封閉內(nèi)源性的c-myc表達(dá)后發(fā)現(xiàn)NDRG2的啟動(dòng)子活性反而略有增加，這可能與myc的過表達(dá)可以抑制NDRG2啟動(dòng)子有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)使NDRG2基因上調(diào)，其有效濃度為40～100 μmol/L，能有效抑制腫瘤細(xì)胞。

4參考文獻(xiàn)

1Stanton BR, Perkins AS, Tessarollo L,etal. Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop〔J〕.Genes Dev,1992;6(12A): 2235-47.

2李劍，林樹新，劉新平，等.一種新的抑癌候選基因：-DNR2在人類正常組織及相應(yīng)腫瘤中的表達(dá)〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002;29(2): 223-7.

3國家藥典委員會(huì).中國藥典臨床用藥須知〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:201.

4沃興德,洪行球,魏佳萍,等.姜黃醇提取物對(duì)高脂血癥患者脂代謝及肝腎功能的影響〔J〕.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1999;23(1):20-2.

5Charron J,Malynn BA,Fisher P,etal. Embryonic lethality in mice homozygous for a targeted disruption of the N-myc gene〔J〕.Genes Dev，1992;6(12A): 2248-57.

6Shimono A,Okuda T, Kondoh H.N-myc-dependent repression of ndr1, a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant〔J〕.Mech Dev,1999;83(1-2): 39-52.

〔2013-09-12修回〕

(編輯袁左鳴)