ATP敏感鉀通道在丹參酮ⅡA對(duì)抗高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能損傷中的作用

胡海燕李躍艷1李春霞2李興3陳夢(mèng)華3周壽紅3

(安化縣第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖南安化413522)

摘要〔〕目的探討ATP敏感鉀通道(KATP)在丹參酮ⅡA(TSA)對(duì)抗高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能損傷中的作用。方法采用離體血管環(huán)灌流方法，檢測(cè)高糖誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷以及血管組織中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性和KATP抑制劑格列本脲(Gly)對(duì)TSA的作用。結(jié)果高糖顯著降低了大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，TSA以濃度依賴的方式抑制了高糖誘導(dǎo)的損傷。高糖顯著降低了血管組織中NO含量和SOD活性而增加了MDA含量，TSA逆轉(zhuǎn)了高糖的作用，而Gly部分取消了TSA的作用。結(jié)論TSA能對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷，其機(jī)制可能與TSA增加NO的釋放，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)； Gly能部分地阻斷TSA的這種保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕ATP敏感性鉀通道；丹參酮ⅡA(TSA)；高糖；內(nèi)皮細(xì)胞；內(nèi)皮依賴性舒張；一氧化氮；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)〔〕R363.2+1〔

通訊作者：周壽紅(1976-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管和老年生理學(xué)研究。

1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科

2安化縣清塘鋪鎮(zhèn)計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)站

3南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

第一作者：胡海燕(1977-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心內(nèi)科及老年疾病的防治研究。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與糖尿病血管并發(fā)癥以及動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關(guān)〔1～4〕。高血糖是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的主要原因〔5，6〕。在高糖環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激增加導(dǎo)致細(xì)胞因子合成及活性的改變是糖尿病血管病變發(fā)病機(jī)制之一〔7，8〕。丹參酮ⅡA(TSA)是丹參的脂溶性有效單體，具有抗缺血、缺氧、改善微循環(huán)、抑制血小板黏附聚集功能和抗血栓形成作用〔9，10〕。研究表明丹參的有效成分丹參素具有鉀通道開放的作用〔11〕。本研究觀察TSA對(duì)血管組織一氧化氮(NO)的產(chǎn)生以及氧化應(yīng)激的影響。

1材料與方法

1.1材料TSA磺酸鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司)。新福林、乙酰膽堿、和阿托品ATP敏感性鉀通道抑制劑格列本脲(Gly)均為Sigma公司產(chǎn)品。D-葡萄糖、甘露醇、NaCl、NaHCO3等其他無(wú)機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。NO檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和 丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。BCA蛋白定量試劑購(gòu)自Pierce公司。BL420F生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都泰盟)；雄性SD大鼠(南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供)。

1.2離體動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組實(shí)驗(yàn)分為以下各組：①對(duì)照組：血管環(huán)用K-H液孵育6 h；②高糖損傷組：血管環(huán)用含D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液孵育6 h誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能的損傷〔4，15〕；③甘露醇組：血管環(huán)用含甘露醇(44 mmol/L)的K-H液孵育6 h；④TSA單獨(dú)處理組：血管環(huán)用含TSN(10-5，10-4，10-3mol/L)的K-H液孵育6 h；⑤不同濃度TSA和D-葡萄糖共同處理組：血管環(huán)用含TSA(10-5，10-4，10-3mol/L)和D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液共同孵育6 h；⑥ATP敏感性鉀通道抑制劑Gly組：血管環(huán)先用Gly(10 μmol/L)預(yù)處理30 min后，再用含TSA(10-3mol/L)和D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液共同孵育6 h。孵育后檢測(cè)乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴型舒張反應(yīng)。動(dòng)脈舒張反應(yīng)以血管舒張張力占新福林(10-6mol/L)預(yù)收縮時(shí)引起的最大收縮張力的百分比表示。并計(jì)算各劑量反應(yīng)曲線的半數(shù)抑制濃度(IC50)，以其負(fù)對(duì)數(shù)值(PD2)表示。

1.3離體動(dòng)脈環(huán)的制備和血管張力的測(cè)定清潔級(jí)成年雄性SD大鼠脫頸椎處死，迅速剝?nèi)⌒刂鲃?dòng)脈，放入預(yù)冷的K-H液中，清除周圍結(jié)締組織，取長(zhǎng)約3 mm的血管環(huán)，固定于加有K-H液的恒溫(37 ℃)浴槽中，持續(xù)通入含95%O2和5%CO2混合氣體。通過(guò)BL420F生物信息采集處理系統(tǒng)記錄胸主動(dòng)脈張力的變化。1.0 g前負(fù)荷下平衡1 h，每15 min換液1次。穩(wěn)定后用100 mmol/L的氯化鉀(KCl)預(yù)刺激，以激發(fā)最大收縮，檢查血管活性。1 μmol/L的新福林預(yù)收縮后，用10 μmol/L的乙酰膽堿舒張胸主動(dòng)脈以檢查血管內(nèi)皮的完整性。各組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)分別進(jìn)行乙酰膽堿介導(dǎo)的舒張反應(yīng)測(cè)定。動(dòng)脈舒張反應(yīng)以血管舒張最小張力占新福林(10-6mol/L)預(yù)收縮時(shí)引起的最大收縮張力的百分比表示。

1.4血管組織中NO含量的測(cè)定取長(zhǎng)約4 cm的血管環(huán)，按上述實(shí)驗(yàn)分組，每組6個(gè)血管環(huán)(分別來(lái)自6只不同的SD大鼠)，孵育結(jié)束后取出血管環(huán)，濾紙上吸干水分，秤重，用電動(dòng)玻璃勻漿器制成10%組織勻漿，勻漿離心(3 000 r/min,10 min)后，取上清液，保存于-20℃冰箱。取不同組血管勻漿的上清液100 μl，按試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)NO2-/NO3-的量，以此代表NO的含量。按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量。

1.5血管組織中SOD活性和MDA含量測(cè)定取不同組血管組織勻漿的上清液100 μl，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)SOD活性和MDA含量。按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS14.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1TSA抑制高糖誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷與對(duì)照組相比，高糖(44 mmol/L)處理顯著降低了乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，表現(xiàn)為濃度-舒張效應(yīng)曲線右上移位，PD2值顯著降低(PD2值對(duì)照組和高糖組分別為6.86±0.45和5.53±0.34，P<0.05)；甘露醇組乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)和PD2值與對(duì)照組間差異無(wú)顯著性(PD2值為6.85±0.53，P>0.05)。單獨(dú)TSA(10-5，10-4和10-3mol/L)處理濃度依賴性地增加了乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，表現(xiàn)為濃度-舒張效應(yīng)曲線右下移位，PD2值顯著性增加(PD2值分別為7.24±0.71，7.73±0.83和7.98±0.91，均P<0.05)；TSA(10-5，10-4，10-3mol/L)濃度依賴性地抑制了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷，表現(xiàn)為濃度-舒張效應(yīng)曲線右下移位，PD2值顯著性增加(PD2值分別為6.05±0.45，6.52±0.64和7.17±0.81，均P<0.05)。

2.2KATP抑制劑拮抗抑制高糖誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷與對(duì)照組相比，KATP抑制劑Gly均沒有影響胸主動(dòng)脈環(huán)乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(PD2值Gly組為6.80±0.57，P>0.05)。與高糖組相比，Gly組沒有影響胸主動(dòng)脈環(huán)乙酰膽堿介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(PD2值高糖+Gly組為5.59±0.43，P>0.05)。而高糖+TSA+Gly組與高糖+ TSA組相比，內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯降低，表現(xiàn)為濃度-舒張效應(yīng)曲線右上移位，PD2值顯著性降低(PD2值分別為5.87±0.48和7.17±0.81，P<0.05)，這表明Gly部分取消了抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷的作用。見表1。

2.3ATP敏感鉀通道抑制劑拮抗抑制高糖誘導(dǎo)的NO水平降低與對(duì)照組相比，高糖處理顯著降低了血管組織中NO的含量(P<0.05)，TSA處理則顯著增加了血管組織中NO的含量(P<0.05)，ATP敏感鉀通道抑制劑Gly單獨(dú)處理沒有影響血管組織中NO含量(P>0.05)；與高糖組相比，高糖+ TSA組血管組織中NO含量顯著增加(P<0.05)；而高糖+ TSA+Gly組與高糖+TSA組相比，血管組織中NO含量顯著降低(P<0.05)，這表明ATP敏感鉀通道抑制劑Gly部分取消了TSA抑制高糖誘導(dǎo)的NO含量降低的作用。

2.4ATP敏感鉀通道抑制劑拮抗TSA抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激見表1。與對(duì)照組相比，高糖處理顯著增加了血管組織中MDA的含量，而降低了血管組織中SOD的活性(均P<0.05)，導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生；TSA處理則顯著降低血管組織中MDA含量，增加了血管組織中SOD活性(均P<0.05)。ATP敏感鉀通道抑制劑Gly單獨(dú)處理沒有影響血管組織中MDA含

組別NO(mmol/g)MDA(μmol/g)SOD(kU/g)對(duì)照組3.87±0.467.85±0.84182.34±21.461)高糖組1.27±0.151)12.69±1.361)87.66±9.131)TSA組(10-3mol/L)7.68±0.861)5.36±0.711)248.12±34.231)Gly組(10μmol/L)4.03±0.547.91±0.96179.22±19.42高糖+TSA組3.55±0.462)7.74±0.642)174.26±15.322)高糖+TSA+Gly組1.32±0.173)12.38±1.423)92.46±8.753)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，與高糖組比較：2)P<0.05，與高糖+TSA組比較：3)P<0.05

量和SOD活性(均P>0.05)；與高糖組相比，高糖+ TSA組血管組織中MDA的含量顯著降低而增加了血管組織中SOD的活性水平顯著增加(均P<0.05)；而高糖+ TSA +Gly組與高糖+ TSA組相比，血管組織中MDA的含量顯著增加而SOD的活性水平顯著降低(均P<0.05)，這表明ATP敏感鉀通道抑制劑Gly部分取消了TSA抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用。

3討論

臨床研究顯示糖尿病病人易出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷，而高糖是導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷的重要原因〔12〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖能顯著降低乙酰膽堿介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，而相同濃度的甘露醇沒有損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，這說(shuō)明高糖環(huán)境損傷了內(nèi)皮的功能與滲透壓的改變無(wú)關(guān)。TSA以濃度依賴的方式抑制了高糖所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)損傷，同時(shí)TSA也直接導(dǎo)致了血管內(nèi)皮依賴性舒張。

內(nèi)皮細(xì)胞中的NO是以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶的作用下產(chǎn)生的。NO 是一種重要的血管舒張因子，能激活血管平滑肌內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP 濃度升高，降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，導(dǎo)致血管舒張。研究顯示TSA能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，舒張血管〔11〕。本結(jié)果表明TSA抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)損傷，可能是通過(guò)增加NO的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受有害刺激后，產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧簇，超出了系統(tǒng)對(duì)其消除能力，過(guò)剩的活性氧對(duì)細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等造成巨大的損傷〔13〕。血管組織中的氧化應(yīng)激可以損傷內(nèi)皮功能，從而導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷?；钚匝蹩梢怨羯锬ぶ械亩嗖伙柡椭舅?，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，其代謝產(chǎn)物MDA是一種有害的過(guò)氧化產(chǎn)物，它的含量反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過(guò)氧化的程度〔14〕。SOD是體內(nèi)重要的氧自由基消除劑，消除活性氧對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖等代謝的影響及其對(duì)細(xì)胞的損傷，使機(jī)體免受損害〔15〕。研究顯示TSA能抑制糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激〔16〕。糖尿病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境是導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要原因〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明TSA抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷可能與TSA抑制了高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)丹參素異丙酯有明顯的擴(kuò)血管作用,其通過(guò)抑制受體介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放而舒張血管,血管平滑肌細(xì)胞膜上的鉀通道參與了丹參素異丙酯的擴(kuò)血管作用〔11〕。KATP通道開放能保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激，防止心肌細(xì)胞的凋亡〔18〕。本結(jié)果表明KATP開放可能是TSA對(duì)抗高糖損傷內(nèi)皮舒張功能的機(jī)制之一?？傊琓SA能對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷，這種保護(hù)作用可能與TSA增加NO的釋放，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)；KATP抑制劑格列本脲能部分地阻斷TSA的這種保護(hù)作用，提示KATP開放可能是TSA對(duì)抗高糖損傷內(nèi)皮舒張功能的機(jī)制之一。

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〔2012-11-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)