不同程度間歇性低氧對大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達的影響

趙雅寧王紅陽1李琳1馬素慧

(河北聯(lián)合大學康復醫(yī)學院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察不同程度間歇性低氧后大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達變化，探討阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)神經(jīng)損傷機制。方法30只雄性SD大鼠隨機分成對照組、輕度間歇低氧組、重度間歇低氧組各10只。對照組暴露于空氣中，間歇低氧組分別暴露于不同低氧條件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露時間每天8 h，持續(xù)時間2 w和8 w)。光鏡觀察額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測上述區(qū)域Bax、Bcl-2表達變化。結(jié)果與對照組比較，隨低氧時間的延長，兩組間歇性低氧組大鼠額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經(jīng)細胞區(qū)死亡神經(jīng)元密度增高；Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；上述變化在重度間歇性低氧組最為顯著(P<0.05)；輕度間歇性低氧組各腦區(qū)死亡神經(jīng)元密度、Bcl-2/Bax比值變化差異顯著，以額葉皮質(zhì)和海馬最明顯(P<0.05)；重度間歇性低氧組各腦區(qū)死亡神經(jīng)元密度、Bcl-2/Bax比值變化差異顯著，以皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)最明顯。結(jié)論間歇性低氧可引起不同腦區(qū)Bcl-2和Bax差異性表達、神經(jīng)細胞差異性丟失；皮質(zhì)、海馬和紋狀體對間歇性低氧損傷更敏感。

關(guān)鍵詞〔〕低氧；凋亡；Bcl-2；Bax

中圖分類號〔〕R563.3〔

基金項目：河北省科技廳資助項目(No. 09276103D-11)

通訊作者：王紅陽(1958-)，女，教授，博士，主要從事呼吸病學研究。

1河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院

第一作者：趙雅寧(1974-)，女，博士，副教授，主要從事呼吸病學研究。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 患者睡眠時反復出現(xiàn)不同程度的低氧血癥和(或)高碳酸血癥，最終引起全身多系統(tǒng)、多器官的漸進性損害。臨床資料顯示OSAHS可造成患者警覺、執(zhí)行能力和運動協(xié)調(diào)方面的認知障礙，而智能、語言障礙屬于相對較輕〔1,2〕。在整個認知形成過程中，腦內(nèi)各個腦區(qū)發(fā)揮的作用并不相同，如額葉和基底節(jié)與人類高級認知即執(zhí)行功能密切相關(guān)；紋狀體主要對運動和技巧進行協(xié)調(diào)。本研究在參考其他學者慢性間歇性缺氧模型基礎上，利用實時氧監(jiān)測的反饋信號模擬臨床呼吸暫停事件的真實狀態(tài)，研究不同間歇性低氧狀態(tài)下不同腦區(qū)腦組織形態(tài)、Bax、Bcl-2表達。

1材料和方法

1.1實驗動物、試劑及儀器雄性SD大鼠60只〔(北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003)〕，體質(zhì)量310～350 g；Bax和Bcl-2試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)；測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科)；純氮(天津六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫(yī)科大學研制)。

1.2動物分組和模型制備30只雄性SD大鼠隨機分成對照組、輕度間歇低氧組(暴露低氧條件100 ml/L，輕度組)和重度間歇低氧組(暴露低氧條件50 ml/L，重度組)各10只。間歇低氧組每天8:00～16:00將實驗動物置于模型艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣和空氣，每次循環(huán)2 min，連續(xù)給予氮氣30 s，分別維持艙內(nèi)氧濃度最低至10%和5%(100 ml/L和50 ml/L)，隨后均復氧至氧濃度21%。對照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi)，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內(nèi)。實驗結(jié)束將實驗動物取出，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。各組每天實驗8 h,實驗持續(xù)時間為2、8 w。對照組暴露于正?？諝庵?；分別在實驗第2、8 w進行所設指標檢測。

1.3腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察光鏡(H-E染色)：各組個時間點5只動物，在規(guī)定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦,后固定24 h ,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋，切片,片厚5 μm。切片二經(jīng)甲苯脫蠟,梯度乙醇降至水, 蘇木精-伊紅染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，采用圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)計數(shù)正常神經(jīng)元，取均值。

1.4免疫組織化學法檢測Bax和Bcl-2常規(guī)麻醉動物，開胸、暴露心，4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1、6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加Bax或Bcl-2抗體(1∶200)， 濕盒中4 ℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV 二步法)，37 ℃溫箱 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片。以 PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析: 每個標本取 4張切片，每張切片在海馬隨機選取 4 個視野，用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析其積分光密度(IOD)值的大小來表示,并作為分析對象進行比較。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2結(jié)果

2.1病理結(jié)果光鏡：對照組額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經(jīng)細胞形態(tài)基本結(jié)構(gòu)正常，排列整齊致密，偶見變性壞死的神經(jīng)元；輕度和重度間歇性低氧組中，隨缺氧時間延長神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷改變，表現(xiàn)為細胞變性水腫和死亡形態(tài)的神經(jīng)細胞。與對照組比較，兩組間歇低氧組額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦區(qū)死亡神經(jīng)元密度隨缺氧時間延長明顯增加(P<0.05)；重度組和輕度組比較，腦區(qū)存死亡經(jīng)元密度進一步增加(P<0.05)；輕度組各腦死亡活神經(jīng)元密度比較差異有統(tǒng)計學意義，以額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)最明顯；重度組各腦區(qū)死亡神經(jīng)元密度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)和紋狀體最明顯。見表1。

組別額葉區(qū)海馬區(qū)紋狀體小腦區(qū)對照組2w1.36±0.581.38±0.581.43±0.581.42±0.568w1.42±0.581.37±0.571.41±0.481.36±0.58輕度組2w4.60±1.601)5.50±1.871)2.97±0.761)3)2.78±0.691)3)8w7.68±2.731)9.95±3.861)5.36±1.541)3)4.48±1.701)3)重度組2w9.03±2.781)2)10.56±3.231)2)8.48±2.731)2)3)6.36±1.581)2)3)4)8w12.85±3.961)2)13.70±3.361)2)12.10±4.101)2)3)9.42±2.821)2)3)4)

與對照組對應時間點比較:1)P<0.05；與輕度組對應時間點比較:2)P<0.05；與同組同時間點額葉區(qū)比較:3)P<0.05；與同組同時間點紋狀體比較:4)P<0.05，下表同

2.2Bax和Bcl-2免疫組織化學結(jié)果顯微鏡下觀察Bax、Bcl-2陽性細胞呈棕黃色，胞質(zhì)著色；對照組額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦偶見陽性細胞出現(xiàn)；輕度和重度組中，隨缺氧時間延長Bax和Bcl-2均表達增高。與對照組比較，間歇低氧組額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)和小腦區(qū)Bcl-2/Bax比值均增加，但隨缺氧時間延長明顯降低(P<0.05)；重度組和輕度組比較，腦區(qū)Bcl-2/Bax比值進一步降低(P<0.05)；輕度組各腦區(qū)Bcl-2/ Bax比值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)最明顯；重度組各腦區(qū)Bcl-2/ Bax比值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)和紋狀體最明顯(表2)。

組別額葉皮質(zhì)海馬區(qū)紋狀體小腦區(qū) 對照組2w0.242±0.0300.25±0.0420.232±0.0510.223±0.0628w0.233±0.060.243±0.0710.244±0.0620.234±0.052 輕度組2w3.791±1.1241)3.670±1.3641)5.936±1.1281)3)7.423±1.1461)3)8w2.689±0.8261)2.382±0.8431)4.048±1.0061)3)5.366±1.1081)3) 重度組2w2.399±0.7621)2)2.147±0.5861)2)3.408±0.3121)2)3)5.415±0.8251)2)3)4)8w1.592±0.4901)2)1.382±0.6261)2)2.208±0.3721)2)3)3.842±0.6731)2)3)4)

3討論

以往的研究多是針對腦內(nèi)某一部位損傷后患者出現(xiàn)某種認知障礙的變化，實際上，認知形成過程中不同腦區(qū)相互協(xié)調(diào)，相互影響。例如額葉處于額葉-紋狀體環(huán)路的調(diào)控中心，其損傷后患者解決問題的技巧最容易受到影響和損傷，而基底節(jié)通過輸出核(蒼白球、丘腦底核、黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))經(jīng)腹外側(cè)丘腦傳送信息至運動皮質(zhì)，完成一般軀體調(diào)控、動眼調(diào)控、邊緣調(diào)控和前額葉調(diào)控等功能，其損傷后亦可出現(xiàn)認知活動中的信息加工困難〔3～5〕。本研究結(jié)果提示一方面間歇低氧對神經(jīng)組織的損傷大腦皮層大于小腦等其他部位，同時不同程度間歇性低氧誘導不同腦區(qū)神經(jīng)細胞死亡程度是不同的，這可能是OSAHS患者存在不同程度和性質(zhì)的認知功能障礙的主要原因之一。

Bcl-2/bax是Bcl-2家族中一對重要因子，二者比值的變化是決定細胞凋亡敏感性的變阻器〔6〕。研究已經(jīng)證實Bax與線粒體ANT作用使MPTP開放、線粒體膜的通透性增加、Cytc釋放、細胞凋亡，而Bcl-2通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜之間基質(zhì)的pH值，增加質(zhì)子流出，提高鈣離子緩沖力，穩(wěn)定線粒體膜結(jié)構(gòu)，維持線粒體跨膜電位來抑制細胞凋亡〔7，8〕。此外Bcl-2表達可引起細胞核谷胱苷肽(GSH)的積聚，導致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，保持缺氧/復氧細胞線粒體成分完整，促進ATP再生，抑制細胞凋亡〔9〕。本研究結(jié)果提示間歇性低氧早期，抗凋亡的保護性作用占優(yōu)勢;而隨時間延長和程度的加重,兩者比值下降,神經(jīng)元受損程度也逐漸加重,趨于死亡，本研究推測不同腦區(qū)Bcl-2和Bax蛋白含量增加以及兩者比值失衡，導致不同腦區(qū)神經(jīng)元發(fā)生凋亡、丟失，存活神經(jīng)元密度降低的機制之一。

總之，本實驗證實了不同程度間歇性低氧導致額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)，紋狀體和小腦部位神經(jīng)細胞丟失，Bcl-2和Bax參與間歇性低氧神經(jīng)損傷過程；Bcl-2和Bax在不同腦區(qū)差異表達和不同腦區(qū)神經(jīng)細胞丟失的差異性可能在一定程度上解釋了OSAHS患者認知功能損害的原因。

4參考文獻

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〔2012-03-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)