電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及受體的影響

劉忠錦張海燕1孫麗慧1郎尉雅1孫忠平

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討電針對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)及受體GFR- a1表達(dá)的影響。 方法通過(guò)Morris水迷宮篩選56只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和電針組，每組14只。正常組常規(guī)飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態(tài)Aβ25～35所致AD模型，模型組造模后不給予任何處理。電針組施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會(huì)、大椎等穴位治療。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，療程4 w。治療后各組大鼠灌注固定后取海馬，用免疫組化和RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬GDNF及受體的表達(dá)。結(jié)果與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)降低明顯(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組大鼠海馬GDNF、 GFR-a1陽(yáng)性細(xì)胞及GDNF mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。結(jié)論電針可能通過(guò)對(duì)AD大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1表達(dá)增強(qiáng)的影響，對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕電針；阿爾茨海默病；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R245.97〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目(No.12521652 )

通訊作者：張海燕(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年癡呆的研究。

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚教研室

第一作者：劉忠錦(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年癡呆的研究。

目前藥物治療阿爾茨海默病(AD)沒(méi)有得到顯著效果〔1，2〕，而且有很大的局限性。針刺具有疏通經(jīng)絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，醒腦開(kāi)竅的功效〔3〕，對(duì)大腦的功能重組和代償起著重要作用。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的新成員，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的定向生長(zhǎng)以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷修復(fù)和神經(jīng)再生等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察電針對(duì)AD大鼠海馬GDNF及受體(GFR-a1)表達(dá)的影響，探討電針改善AD學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器鹽酸多奈哌齊(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H20030472)，β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35(Sigma公司)，大鼠抗GDNF單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗大鼠GFR-al多克隆抗體(R&D)，RNA抽提試劑盒TrizolReagent(Gibco)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，GDNF分子引物序列:正義5′-GACTCCAATGTGCCCGAAGA-3′，反義5′-CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC-3′，該引物產(chǎn)生426 bp的cDNA片段,β-actin分子引序列:正義5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反義5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′，該引物產(chǎn)生200 bp的cDNA片段由北京三博生物科技有限公司合成，十二烷基硫酸鈉(SDS，上海生工生物工程公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，F(xiàn)luka公司)。 腦立體定位儀(NARISHIGESN-2型),Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所),電針儀(上海華誼G6805-1A型)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51,日本)。

1.2動(dòng)物選擇及分組清潔級(jí)健康4月齡雄性Wistar大鼠60只，體重200～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(批號(hào)：2011003)，室內(nèi)常溫下常規(guī)飼養(yǎng)，經(jīng)水迷宮測(cè)試，篩選出其中56只，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和電針組，正常組常規(guī)飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態(tài)Aβ25-35所致AD模型，模型組采用造模后不給予任何處理。電針組采用造模后施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會(huì)、大椎等穴治療，用 0.25×0.25 mm2華佗牌無(wú)菌毫針針刺，連接G6805-1A型電針儀，電壓為2 V，頻率為30 Hz，強(qiáng)度以肢體局部輕微顫動(dòng)為適。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，每日0.6 mg/kg，療程4 w。

1.3模型復(fù)制10%水合氯醛3 ml/kg使大鼠麻醉后，固定在腦立體定位儀上。消毒皮膚,剪毛，在頭部做正中矢狀切口，牙科鉆孔器鉆顱有突破感，坐標(biāo)為腦表面下3.5 mm,前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開(kāi)1.5 mm。在每側(cè)側(cè)腦室注射10%鏈脲霉素10 μl。用微量進(jìn)樣器抽取2 μl Aβ25～35(用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成10 μg /pl)37℃孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。創(chuàng)口縫合飼養(yǎng)，3 d后重復(fù)注射，術(shù)后大鼠每天肌注青霉素4萬(wàn)單位預(yù)防感染〔4〕。

1.4各組大鼠標(biāo)本的制備各組大鼠治療4 w，麻醉后固定于鼠板上，行胸腹聯(lián)合切口，切斷肋骨、膈肌，暴露出心臟，在左心室插入灌注針頭，快速灌入生理鹽水500 ml沖出組織內(nèi)血液，剪開(kāi)右心耳，沖洗到肝臟變白，然后注入4%多聚甲醛,當(dāng)大鼠尾巴、四肢僵硬為達(dá)到效果，取腦分離海馬〔5〕。一側(cè)海馬保存至液氮罐內(nèi)，一側(cè)置于4%多聚甲醛中固定24 h，取海馬標(biāo)本，冠狀切片，片厚4 μm，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及石蠟包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行貼片，將附貼好的切片置于恒溫箱內(nèi)干燥。

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)GDNF和GFR-a1(SP法)石蠟切片脫蠟、水化后,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，微波修復(fù)抗原,每張切片加抗GDNF抗體或者GFR-a1抗體,4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，加入生物素標(biāo)記的第二抗體室溫下孵育10 min，再加入鏈霉菌抗生物素一過(guò)氧化物酶溶液室溫下孵育10 min，PBS沖洗后加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液5～10 min，常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封片。用Image-ProPlus分析軟件進(jìn)行圖像分析,每組切片取10個(gè)視野測(cè)定積分吸光度,取平均值代表GDNF 和GFR-a1表達(dá)。

1.6RT-PCR測(cè)定測(cè)定大鼠海馬GDNF mRNA各組大鼠海馬組織PBS沖洗,勻漿后采用Trizol法獲得RNA，RT-PCR反應(yīng)按試劑盒嚴(yán)格操作,PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物(內(nèi)標(biāo)取2.5 μl)加2 μl(6倍)樣品緩沖液混勻后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳30 min。瓊脂糖電泳凝膠條帶經(jīng)Bio-Rad Quantity one 4.4.0圖像分析系統(tǒng)采集電泳圖像，并進(jìn)行半定量分析，結(jié)果用基因擴(kuò)增條帶吸光度與內(nèi)參照β-actin光密度值的比值表示。

2結(jié)果

2.1治療后免疫組織化學(xué)檢測(cè)GDNF和GFR-a1的表達(dá)與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF和GFR-a1表達(dá)明顯下降(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別GDNF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)GFR-a1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)正常組109.62±7.911)113.57±8.131)模型組67.54±7.3578.16±7.26西藥組91.27±6.731)97.98±7.151)電針組92.98±7.461)99.62±6.811)

與模型組比較：1)P<0.05

2.2治療后RT-PCR測(cè)定各組大鼠GDNF mRNA比較與正常組大鼠比較，模型組GDNF mRNA含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組含量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

1 正常組，2 模型組，3 電針組，4 西藥組 圖1　RT-PCR測(cè)定各組大鼠GDNF mRNA的表達(dá)

3討論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類(lèi)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的非常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)〔6〕,1993年在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞系B49中發(fā)現(xiàn)了GDNF，GDNF通過(guò)招募GDNF受體及其酪氨酸激酶蛋白形成復(fù)合物激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)，GFR-a1與GDNF的親和性最強(qiáng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞約占正常成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的40%，研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞能釋放GDNF等大量的活性物質(zhì),對(duì)膽堿能神經(jīng)受損后具有保護(hù)作用，并能預(yù)防和延緩膽堿能神經(jīng)元的退行性病變〔7〕。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為人到老年氣郁、氣虛,均可致血癖，而癖血入腦，精髓枯萎而癡呆。百會(huì)屬于督脈，針刺百會(huì)可以激發(fā)督脈及其他經(jīng)脈的經(jīng)氣，開(kāi)竅醒腦，疏通腦絡(luò)淤滯，起到治療癡呆之功效。而太溪穴為補(bǔ)腎要穴，有調(diào)補(bǔ)腎氣之功，腎藏精、生髓，髓充精足則腦之神明得用。國(guó)內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)電針對(duì)于健忘和神智的恢復(fù)有較好的治療效果〔8，9〕。

本研究表明電針刺激AD大鼠海馬GDNF及其受體正向調(diào)節(jié)，進(jìn)一步對(duì)受損神經(jīng)元起到保護(hù)和修復(fù)作用，所以AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效防治老年性癡呆的作用機(jī)制。

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〔2013-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)