丹紅注射液對阿霉素大鼠心肌損傷的保護作用

彭小平陳璿瑛1李文娟2王夢洪鄭澤琪

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心內科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討丹紅注射液(DH)對阿霉素(ADR)所致大鼠心肌損傷的影響及作用機制。方法腹腔注射ADR建立大鼠心肌損傷模型，隨機分為對照組、DH組、ADR組、DH+ADR組，各10只。觀察大鼠生理狀況，比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量，流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位。結果與ADR組相比，DH預處理能顯著改善ADR所致的體重下降，降低LDH、CK的活性和MDA的含量，增強SOD、CAT和GSH-Px的活性。線粒體膜電位數據顯示，與ADR組相比，DH顯著增加心肌細胞線粒體膜電位。結論DH對ADR所致大鼠心肌損傷具有顯著的保護作用，其保護作用與降低心肌氧化應激，提高抗氧化防御和穩(wěn)定線粒體膜電位有關。

關鍵詞〔〕丹紅注射液；心肌損傷；氧化應激；阿霉素

中圖分類號〔〕R544.1〔

基金項目：江西省衛(wèi)生廳課題(No.20081026);南昌大學?；?2009)

1南昌大學第一附屬醫(yī)院藥劑科

2南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室

第一作者：彭小平(1975-)，男，副教授，在職博士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病治療研究。

臨床發(fā)現長期使用阿霉素(ADR)可產生嚴重的心臟毒性。因此，研究ADR所致心肌損傷的作用機制及尋找有效的防治措施，已成為當今醫(yī)學界迫在眉睫的問題〔1，2〕。 研究表明ADR所致心臟毒性機制頗為復雜，目前較為深入并被廣泛認可的作用機制是ADR過量產生自由基導致心肌損傷。ADR進入心肌細胞后，在微粒體中經過還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細胞色素P450還原酶催化并提供一個電子變?yōu)閹б粋€剩余電子的半醌自由基，經過一系列的電子傳遞，進而形成氧化應激，最后導致了組織的損傷〔3，4〕。研究證實丹紅注射液(DH)具有抑制氧化應激和提高機體抗氧化防御能力，且對缺血性心肌損傷有保護作用，但對抗腫瘤ADR引起心肌損傷的影響尚不清楚〔5，6〕。本研究探討DH對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物和試劑健康SD大鼠40只，體重(200±20) g，由南昌大學醫(yī)學院實驗動物部提供〔許可證號：SCXK(贛)2006-2001〕。DH 購自菏澤步長制藥有限公司。ADR由深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產。過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒。細胞乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶(CK)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；羅丹明123(Rho 123)購自美國Molecular Probes公司。本研究中其余化學試劑均為分析純產品。

1.2儀器設備流式細胞分析系統(tǒng)(Beckman Coulter公司，美國)；移液器(Eppendorf公司 德國)；紫外分光光度計(中國北京普析通用儀器有限責任公司)；離心機(中國上海安亭科學儀器廠)；超純水凈化系統(tǒng)(Millipore公司，美國)；電子天平(中國上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3實驗方法采用隨機平行同期對照的方法，建立大鼠ADR心肌損傷模型，40只大鼠隨機分為對照組、DH組、ADR組、DH+ADR組，各10只。對照組：連續(xù)8 d腹腔注射生理鹽水0.2 ml；DH組：連續(xù)7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的生理鹽水；ADR組連續(xù)7 d腹腔注射生理鹽水0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的ADR 20 mg/kg；DH+ADR組：連續(xù)7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的ADR 20 mg/kg。所有的動物飼養(yǎng)于環(huán)境溫度(20±2)℃，濕度(50±10)%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由取食，并且于第14天處理大鼠〔7〕。

1.4實驗樣本的收集大鼠稱重，固定大鼠，摘取眼球取血，制備血清。采血后脫臼處死，迅速開胸取出心臟，稱重，分離部分心臟，用于生化分析。

1.5檢測指標與方法

1.5.1小鼠癥狀與體征觀察大鼠的精神狀況、飲食、體表和體重等。

1.5.2心肌組織中LDH和CK活性的測定稱取部分心肌組織加預冷的生理鹽水，制備5%的心肌組織勻漿。將組織樣品在冰浴下剪碎，保持低溫環(huán)境使用組織粉碎機分3次粉碎組織，20 s/次，并用預冷的生理鹽水沖洗粉碎機的攪拌器，盡可能減少組織損耗；然后用超聲波組織細胞粉碎機再進行2次粉碎，8 s/次；最后按比例補充預冷的生理鹽水，4℃離心5 min，吸取上清得終濃度5%的組織勻漿。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定組織勻漿中的蛋白含量。使用LDH和CK試劑盒，并參照說明書方法測定并換算LDH、CK的活力(U/mg)。

1.5.3心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測定按照以上方法，將組織勻漿，離心，收集上清，最終制備5%的組織勻漿，測定蛋白質的含量。使用SOD、GSH-Px、CAT和MDA試劑盒，參照說明書檢測組織勻漿并換算其SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.5.4細胞線粒體膜電位(△Ψm)的檢測分離心肌組織，剪碎，胰酶消化，含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，離心5 min制備并收集心肌細胞。100 μl PBS重懸細胞，加入0.5 mg/ml羅丹明123母液5 μl，37℃孵育30 min，離心5 min，棄上清，500 μl PBS洗2次后重懸細胞，避光，立即應用流式細胞分析系統(tǒng)進行定量檢測。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1大鼠的生理狀況在進行ADR腹腔注射前，對照組、DH組、ADR組、DH+ADR組中大鼠攝食、活動、糞便等一般情況良好，皮毛光滑。各組間體重無顯著差異。開始給予ADR 5 d后，發(fā)現ADR組中大鼠均出現不同程度的脫毛、腹瀉的狀況，大鼠進食進水量大量減少，然而與DH預處理組相比，體重顯著增加(P<0.01)。表明，DH對ADR引起的生理狀況變化具有保護作用。見圖1。

2.2大鼠心肌組織中LDH和CK的變化大鼠經ADR處理后，其LDH、CK活性明顯增加，大鼠經DH預處理組的LDH、CK活性明顯減低。表明DH對ADR引起的心肌細胞損傷有很強的保護作用。見表1。

2.3大鼠心肌組織中MDA含量的變化與對照組相比，ADR處理組心肌細胞內的MDA 含量顯著增高。DH預處理大鼠后，細胞內MDA的含量顯著降低。表明DH預處理抑制ADR引起的氧化應激。見表1。

與對照組比較：1)P<0.01；與ADR組比較：2)P<0.01 圖1　DH對ADR處理大鼠體重的影響

表1DH對ADR處理大鼠心肌組織中各項指標的影響

指標對照組DH組ADR組DH+ADR組LDH(U/mg)43.51±2.1543.37±2.4289.19±5.251)54.56±3.171)3)CK(U/mg)3.57±0.623.28±0.316.07±0.791)3.23±0.351)3)MDA(nmol/mg)11.01±1.0610.87±0.9220.17±1.561)14.78±1.111)2)SOD(U/mg)117.78±6.87109.99±6.2550.68±4.231)83.79±7.121)2)CAT(U/mg)131.07±7.99129.82±8.1039.78±4.641)76.09±6.691)2)GSH-Px(U/mg)353.78±20.31360.37±19.16134.78±6.891)291.78±11.151)2)Δψm381.78±16.89372.86±17.41173.13±7.361)298.87±11.621)2)

與對照組比較：1)P<0.01；與ADR組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.4大鼠心肌組織中SOD、CAT和GSH-Px活性的變化與對照組相比，模型組中SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低。DH預處理組與模型組相比，各酶活性均有升高，SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著增加。表明DH能增強ADR處理大鼠的心肌抗氧化能力。見表1。

2.5大鼠心肌組織中△Ψm的變化模型組線粒體膜電位△Ψm顯著下降，而DH+ADR組中△Ψm顯著增加。表明DH減輕ADR引起的心肌損傷，與其保護△Ψm有關，見表1。

3討論

自由基是人體正常的代謝產物，正常情況下機體內的自由基是處于不斷產生與消除的動態(tài)平衡中。過量產生氧自由基所導致的氧化損傷是ADR引起心臟毒性的主要原因，而線粒體呼吸鏈又是自由基產生的主要部位，故其本身易成為自由基損傷的主要靶點〔8〕。本研究采用急性ADR心肌損傷大鼠模型，考察了DH對ADR心肌損傷的影響，進一步研究其對氧化損傷和線粒體的保護作用〔9〕。

SOD、CAT、GSH-Px 是機體內清除氧自由基的重要抗氧化酶，兩者活力的高低分別反映了機體內源性清除超氧陰離子及過氧化氫的能力，而過氧化氫在ADR心肌毒性中似乎起著更突出的作用〔10，11〕。SOD 是體內清除自由基的關鍵酶，也是重要的抗氧化酶之一，研究表明，隨著年齡的增長，SOD清除氧自由基的能力逐漸下降，引起不飽和脂肪酸氧化生成過氧化物，使DNA、蛋白質和酶等改變、破壞從而加速衰老。SOD 通過催化超氧陰離子歧化為H2O和O2，從而達到清除自由基，抗衰老的作用〔12〕。一般認為，SOD對維護機體活性氧ROS的低水平是必要的，而GSH-Px則對防止體內自由基引起的膜脂質過氧化尤其重要〔13〕。GSH-Px 是機體一種抗氧化的重要酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化物的還原反應。GSH-Px不直接清除自由基，其作用在于阻斷由過氧化物引發(fā)的自由基對肌體的損害，保護細胞膜免受過氧化的損傷。GSH-Px 亦可與CAT 協(xié)同作用，催化對生物體有害的H2O2的分解，以減少自由基和過氧化脂質的形成〔14〕。盡管CAT 不能直接清除·OH，但其可以降低過氧化氫的濃度，從而起到減輕氧化應激損傷〔15〕。因此檢測心肌組織中的這些抗氧化物酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性可以反映組織中抗氧化防御能力的變化。理論上，氧自由基理論中的ADR引起的心臟毒性必然導致過氧化物酶的過量消耗，繼而組織內酶的活力可能會明顯下降〔16〕。本實驗結果驗表明DH處理對ADR引起的大鼠心肌損傷具有保護作用，且進一步研究發(fā)現該保護作用與其提高大鼠心肌組織抗氧化防御能力有關。

本研究中發(fā)現，DH的發(fā)揮心肌保護作用的同時，對心肌的線粒體具有保護作用。ADR急性心臟毒性還有一個機制就是線粒體途徑，通過線粒體膜電位Δψm的降低，繼而誘導線粒體鈣離子通透性轉換通道(mPTP)孔的開放，從線粒體基質將鈣釋放，導致線粒體生物能量衰竭而心肌細胞嚴重損傷甚至凋亡〔17，18〕。本實驗印證了ADR能引起心肌細胞線粒體的膜電位Δψm的下降，同時，DH能顯著抑制Δψm的下降。由此可知，DH對心臟毒性的保護作用可能與保護線粒體功能，穩(wěn)定Δψm有關。本研究說明DH能通過提高抗氧化防御能力對ADR引起的心臟毒性具有保護作用。

4參考文獻

1Zhu SG，Kukreja RC，Das A,etal.Dietary nitrate supplementation protects against Doxorubicin-induced cardiomyopathy by improving mitochondrial function〔J〕.J Am Coll Cardiol，2011；57(21):2181-9.

2Patel N，Joseph C，Corcoran GB,etal.Silymarin modulates doxorubicin-induced oxidative stress，Bcl-xL and p53 expression while preventing apoptotic and necrotic cell death in the liver〔J〕.J Toxicol Appl Pharmacol，2010；245(2):143-52.

3陽冠明，李樹全，葉司原，等.S-甲基異硫脲對阿霉素致大鼠心肌脂質過氧化的影響〔J〕.中國藥理學通報，2004；20(11)：1231-4.

4Li WJ，Nie SP，Xie MY,etal.A major green tea component，(-)-epigallocatechin-3-gallate，ameliorates doxorubicin-mediated cardiotoxicity in cardiomyocytes of neonatal Rats〔J〕.J Agr Food Chem，2010；58(16):8977-82.

5孔秀玲.丹紅注射液治療心腦血管疾病療效觀察〔J〕.中國保健營養(yǎng)，2012；1(6)：1524-5.

6王珺楠，劉斌，宋春莉.丹紅注射液對大鼠心肌缺血損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2010；30(17)：2481-3.

7Ascens?o A，Lumini-Oliveira J，Machado NG,etal.Acute exercise protects against calcium-induced cardiac mitochondrial permeability transition pore opening in doxorubicin-treated rats〔J〕.J Clin Sci (Lond)，2011；120(1):37-49.

8Hoye AT，Davoren JE，Wipf P,etal.Targeting mitochondria〔J〕.Acc Chem Res，2008；41(1):87-97.

9吳運香，張野，謝春林，等.SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評價〔J〕.中國藥理學通報，2011；27(8)：1170-3.

10卓燁燁，林煥冰，周恒，等.咯利普蘭對H2O2致PC12細胞氧化應激損傷的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2010；26(11)：1429-35.

11Li WJ，Nie SP，Yan Y,etal.The protective effect of Ganoderma atrum polysaccharide against anoxia/reoxygenation injury in neonatal rat cardiomyocytes〔J〕.Life Sci，2009；85(17-18)：634-41.

12門秀麗，趙霞，趙利軍，等.?；撬釋?型糖尿病大鼠胰腺線粒體氧化應激的影響〔J〕.中國藥理學通報，2009；25(10)：1373-5.

13Collins AR.Oxidative DNA damage，antioxidants and cancer〔J〕.Biol Essays，1999；21(3)：238-46.

14李逢春，安玉會.決明子抗衰老實驗研究〔J〕.科技信息:學術研究,2008；(26):82.

15張忠華，朱萱萱,倪文彭，等.首烏軟膠囊對衰老小鼠GSH-Px、CAT的影響〔J〕.實用中醫(yī)內科雜志，2009；23(1)：25-6.

16Fajardo G，Zhao M，Berry G,etal.β2-adrenergic receptors mediate cardioprotection through crosstalk with mitochondrial cell death pathways 〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;51(5):781-9.

17蔡循.線粒體跨膜電位與細胞凋亡〔J〕.生物化學與生物物理進展，2001；28(1):3-6.

18Kalivendi SV，Konorev EA，Cunningham S,etal.Doxorubicin activates nuclear factor of activated T-lymphocytes and Fas ligand transcription：role of mitochondrial reactive oxygen species and calcium 〔J〕.Biochem J，2005；389(Pt 2):527-39.

〔2012-12-01修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)