胸苷酸合酶基因遺傳多態(tài)性與股骨頭壞死的關(guān)聯(lián)性

吳昌新吳國志王暉陳文生

(海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院骨科，海南海口571101)

摘要〔〕目的探討胸苷酸成酶(TS)5′非編碼區(qū)28 bp重復序列(rs34743033)及3′非編碼區(qū)遺傳多態(tài)性(rs34489327)與海南中老年人群股骨頭壞死的關(guān)聯(lián)性。方法選擇海南省股骨頭壞死患者216例作為實驗組，健康對照216例作為對照組，利用PCR方法及焦磷酸測序法檢測胸苷酸合成酶基因的遺傳多態(tài)性。結(jié)果TS 基因rs34743033多態(tài)位點3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型實驗組中的分布頻率為79例(36.6%)、68例(31.5%)、69例(31.9%)，在對照組中為103例(47.7%)、76例(35.2%)、37例(17.1%)，組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，3R/3R在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而2R/2R的頻率明顯高于對照組。TS基因rs34489327多態(tài)性位點可檢測出三種基因型，+6 bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在實驗組中的分布頻率為68例(31.5%)、83例(38.4%)、65例(30.1%)，在對照組中為95例(44.0%)、78例(36.1%)、43例(19.9%)，組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，+6 bp/+6 bp在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的頻率明顯高于對照組。結(jié)論基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp可能是股骨頭壞死的危險因素。

關(guān)鍵詞〔〕股骨頭壞死;胸苷酸合酶;股骨頭壞死;基因多態(tài)性

中圖分類號〔〕R68〔

第一作者：吳昌新(1969-)，男， 副主任醫(yī)師，主要從事骨科疾病的臨床與科研工作。

胸苷酸合酶(TS)基因定位于第18號染色體上18p11.32，其編碼的TS是嘧啶核苷酸合成的限速酶，控制體內(nèi)胸苷酸的合成，與細胞分裂等生命活動密切相關(guān)〔1〕。5’UTR和3‘UTR的核苷酸序列及結(jié)構(gòu)是影響基因表達水平的重要因素。TS基因5’端轉(zhuǎn)錄起始點上游存在28個堿基對(bp)的串聯(lián)重復序列(VNTR )結(jié)構(gòu)，該序列與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后可能刺激和增強啟動子的活性，從而影響基因表達效率〔2〕；該序列存在個體差異，在GenBank中的序列號為rs34743033。TS基因3’端1 494 bp處存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入(rs34489327)，該多態(tài)性可能通過影響TS mRNA的穩(wěn)定性從而影響TS基因的表達〔3〕。股骨頭壞死是嚴重影響患者生命質(zhì)量的骨科疾病，目前臨床上沒有特效方案。本文擬探討TS UTR多態(tài)性與股骨頭壞死的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選取海南省2010～2013年股骨頭壞死患者216例作為實驗組，男151例，女65例，年齡40～65歲，平均58歲，病程1～15年。選擇216例健康人群作為對照組，男151例，女65例，年齡45～65歲，平均57.6歲。排除創(chuàng)傷性股骨頭壞死、器質(zhì)性疾病、慢性病、骨質(zhì)疏松等患者。

1.2基因多態(tài)性檢測①DNA提?。翰捎肣IAamp?DNA Blood Kit提取全血DNA，采用NanoDrop2000微量紫外分光光度計(Thermo SCIENTIFIC)進行質(zhì)量控制。② TS基因5’端重復序列檢測：采用PCR擴增加瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測TS基因5’端轉(zhuǎn)錄起點上游附近存在的28 bp的NVTR多態(tài)性。設計上游引物：5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’，下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，2R/2R基因型擴增片段為222 bp，3R/3R基因型大小為250 bp，2R/3R基因型出現(xiàn)222 bp和250 bp的兩條帶。反應體系：2倍QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10 μl，上游引物和下游引物各0.2 μl，模板DNA 2 μl，滅菌蒸餾水補足至20 μl。反應條件：98℃預變性15 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，60 s，40個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。分型結(jié)果的判定方法：出現(xiàn)一條222 bp的單一條帶為2R/2R基因型，出現(xiàn)一條250 bp的單一條帶為3R/3R基因型，出現(xiàn)222 bp和250 bp兩條帶則為2R/3R基因型。③3’端UTR多態(tài)性(3’非編碼區(qū)的1 494 bp處6 bp核苷酸片段的缺失或插入)檢測：采用焦磷酸測序技術(shù)進行3’端UTR多態(tài)性檢測。上游引物5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’， 下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，測序引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，其中下游引物5’末端進行生物素標記。

1.3統(tǒng)計學分析利用SPSS16.0軟件行χ2檢驗。

2結(jié)果

如表1所示，TS基因5’端非編碼區(qū)3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型分布頻率組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，3R/3R在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而2R/2R的頻率明顯高于對照組。TS 基因3’端非編碼區(qū)1 494 bp處6 bp核苷酸片段的缺失或插入多態(tài)性位點可檢測出三種基因型，+6bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在實驗組與對照組中的分布頻率差異顯著水平(χ2=9.1，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，+6 bp/+6 bp在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的頻率明顯高于對照組。

表1股骨頭壞死患者與健康對照組非編碼區(qū)兩個遺傳多態(tài)位點的基因型比較〔n(%),n=216〕

突變位點基因型實驗組對照組χ2值P值5'UTRrs347430333R/3R79(36.6)103(47.7)13.270.0012R/3R68(31.5)76(35.2)2R/2R69(31.9)37(17.1)3'UTRrs34489327+6bp/+6bp68(31.5)95(44.0)9.10.01+6bp/-6bp83(38.4)78(36.1)-6bp/-6bp65(30.1)43(19.9) +6bp/-6bp+-6bp/-6bp148(68.5)3)121(56.0) +6bp/+6bp+6bp/-6bp151(69.9)4)173(80.1)

與3R/3R比較：1)P<0.05；與2R/2R比較：2)P<0.05；與+6 bp/+6 bp比較：3)P<0.01;與-6 bp/-6 bp比較：4)P<0.05

3討論

股骨頭壞死是嚴重影響患者生存質(zhì)量的一類骨科疾病，其病因和發(fā)病機制較為復雜，是由多重遺傳學因素與環(huán)境因素相互作用，眾多病理過程參與，引起股骨頭發(fā)生部分或者完全性缺血導致骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞壞死而導致的疾病〔4〕。

組織缺血是股骨頭壞死的直接病因，在創(chuàng)傷性股骨頭壞死過程中，毛細血管細胞的分裂有密切關(guān)聯(lián)。TS是體內(nèi)胸苷酸合成的限制酶，控制細胞分裂過程中DNA的生物合成過程，對細胞周期具有重要影響。 Shintani等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，rs34743033基因型與mRNA表達水平存在相關(guān)性。TS基因3’端1 494 bp處存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入，其多態(tài)性也可能通過影響TS mRNA的穩(wěn)定性從而影響TS基因的表達。Mandola等〔6〕通過體外熒光標記檢測、體內(nèi)測定mRNA水平的方法發(fā)現(xiàn)，包含+6 bp多態(tài)基因型的熒光活性和mRNA水平出現(xiàn)了約35%的衰減，而包含-6 bp的基因型出現(xiàn)了約70%的衰減；同時含有-6 bp的基因型與含有+6 bp的基因型相比出現(xiàn)了較高的降解率；+6 bp/+6 bp基因型的TS mRNA水平明顯高于-6 bp/-6 bp基因型。因此他們認為-6 bp等位基因在體外降低TS mRNA的穩(wěn)定性，在體內(nèi)降低TS的表達。

本研究結(jié)果顯示，基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp不能是股骨頭壞死的危險因素。

4參考文獻

1Ofi T,Takahashi E.Ayuzawa D，etal．Regional assignment of the human thymidylate synthasc(TS) gene to chromosome band 18pl1.32 by nonisetopic in situ by hybridization〔J〕.Hum Genet,1990;85(5):576-80．

2Lacopetta B，Grieu F，Joseph D，etal．A polymorphism in the enhancer region of the thymidylate synthnse promoter influences the survival of colorectal cancer patients treated with 5-fluomuraeil〔J〕．Br J Cancer，2001;85(7)：827-30．

3Rich CM，Bigier J，Velicer CM，etal.Searching expressed sequence tag database：discovery and confirmation of a common polymorphism in the thymidylate synthase gene〔J〕.Cancer Epidemiol Biomark Prev，2000;9：1381-5.

4韓金寶,畢鄭鋼.老年股骨頭缺血壞死的臨床診斷及治療現(xiàn)狀〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(5)：1089-91.

5Shintani Y，Ohta M，Hirabaynshi H，etal．New prognostic indicator for non-small-cell lung cancer，quantitation of thymidylate synthase by real-time reverse transcription polymemse chain reaction〔J〕．Int J Cancer，2003;104(7)：790-5．

6Mandola MV,Stochlmaeher J,Zhang W，etal．A 6 bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associat-ed with decreased intratumoral TS mRNA levels〔J〕．Pharmacogenetics，2004;14：319-27．

〔2013-07-11修回〕

(編輯徐杰)