黃宜，劉振民，莫蓓紅，郭本恒，吳正鈞

(1.光明乳業(yè)股份有限公司上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436;2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306)

干酪，又名奶酪，有各式各樣的味道、口感和形式。干酪以奶類為原料，含有豐富的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，因此具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［1］。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，對(duì)像干酪這種高營(yíng)養(yǎng)健康食品需求量越來(lái)越多［2］。據(jù)海關(guān)信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)奶酪進(jìn)口量從2004 年的7 244.1 t 增加到2013 年的47 330.9 t，年平均增長(zhǎng)率為23.2%。

在干酪生產(chǎn)和成熟過(guò)程中，微生物菌群促進(jìn)了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的形成。這些微生物主要包括發(fā)酵劑微生物和非發(fā)酵劑微生物［3］。發(fā)酵劑微生物包括中溫發(fā)酵劑中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和明串珠菌屬(Leuconostoc.spp)等，嗜熱型發(fā)酵劑中的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)和瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)等［4］。發(fā)酵劑微生物的作用是在干酪生產(chǎn)過(guò)程中能夠快速發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生高濃度的乳酸，提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清和抑制有害菌生長(zhǎng)。非發(fā)酵劑菌群主要是指乳酸菌(LAB)，在切達(dá)和荷蘭式干酪中最常見的是嗜溫乳酸菌，它們對(duì)干酪獨(dú)特風(fēng)味和眼孔的形成以及增強(qiáng)微生物的生存能力具有重要作用［5-6］。除了添加的發(fā)酵劑外，還存在著一些來(lái)自生產(chǎn)和加工過(guò)程中混入的微生物，對(duì)干酪也有一定影響。干酪中微生物的特點(diǎn)是大量的細(xì)菌、酵母和霉菌的共存，且許多因素影響它們的生存與生長(zhǎng)［7］。

本研究從中國(guó)傳統(tǒng)乳制品中分離到的嗜溫性乳酸菌進(jìn)行篩選，將不同特性的乳酸乳球菌與產(chǎn)香型明串珠菌進(jìn)行組合，以達(dá)到快速產(chǎn)酸型和產(chǎn)香型發(fā)酵劑結(jié)合的目的，應(yīng)用于高達(dá)干酪模型中，了解干酪在成熟期的風(fēng)味變化。為天然干酪的生產(chǎn)、品質(zhì)評(píng)定提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

供試菌株，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光明乳業(yè)菌種保藏中心提供;CHOOZIT RM 32 型直投式發(fā)酵劑;MARZYME150MG 型凝乳酶;M17agar、M17肉湯培養(yǎng)基、氯化鈉、蔗糖均為分析純;脫脂乳粉，食品級(jí);無(wú)抗生素鮮牛奶。

GC 6890 N 氣相色譜議;5975 MSD 質(zhì)譜儀;100 μm的PDMS(2 cm)固相微萃取萃取頭;DELTA 320 型pH 計(jì);UV 2300 型紫外分光光度計(jì)。

1.2 菌株活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的41 株乳酸乳球菌和47 株明串珠菌從凍存管中取出，以2%(v/v)的接種量接種于經(jīng)過(guò)121 ℃、15 min 滅菌的M17 肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)36 h，連續(xù)活化三代。

1.3 菌株的初步篩選

1.3.1 模擬干酪成熟環(huán)境初篩 將活化好的菌株接種在含有NaCl 濃度4%，pH 值為5.0 的液體M17培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.2 菌株不同溫度環(huán)境生長(zhǎng)測(cè)試 將活化好的菌株接種在M17 平板中，分別置于15，30，40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 ～72 h，觀察平板上面菌落的生長(zhǎng)情況［8］。

1.3.3 菌種鑒定 將初篩符合條件的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取細(xì)菌基因組的DNA，對(duì)16 S rDNA 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定與分析。

1.3.4 對(duì)產(chǎn)香型明串珠菌的篩選 將活化好的明串珠菌按2%的量接種于裝有100 mL 脫脂乳培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16 h，進(jìn)行產(chǎn)香評(píng)定。評(píng)估小組由6 名專業(yè)感官評(píng)價(jià)人員組成，對(duì)每個(gè)菌株的發(fā)酵脫脂乳香味進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)各自判斷對(duì)不同菌株發(fā)酵脫脂乳的香味濃度進(jìn)行打分，以“+”表示濃度的強(qiáng)度，最高為“+ + + + +”。

1.4 菌株的特性測(cè)試

1.4.1 菌株的產(chǎn)酸性能 將各菌株按1%(v/v)的量接種于裝有脫脂乳液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 h 取出一支三角瓶，以未接種的脫脂乳液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，測(cè)pH 值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制各菌株在脫脂乳中pH 值的變化曲線。

1.4.2 菌株在脫脂乳中的凝乳時(shí)間和黏度測(cè)定將各供試菌株分別以1%(v/v)的量接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，直至凝乳，并于4 ℃環(huán)境下保存24 h，用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)分別測(cè)定各發(fā)酵酸乳的黏度(mPa·s)，測(cè)定時(shí)選擇2 號(hào)轉(zhuǎn)子，速度設(shè)置為64 r/s，每隔15 s 取值1 次，測(cè)定3 min。

1.4.3 發(fā)酵牛乳特性測(cè)試 將各供試菌株分別以1%(v/v)的量接種于滅菌脫脂乳中，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，待凝乳后考察其風(fēng)味、乳清析出狀況及凝塊質(zhì)地。

1.4.4 菌株蛋白酶活力測(cè)試 福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力:取1 mL pH 7.0、濃度為2%酪蛋白底物緩沖液，加入1 mL 酶液后迅速混勻，并立即放入40 ℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，10 min 后立即加入0.4 mol/L TCA 溶液2 mL，終止反應(yīng)。離心除去酪蛋白沉淀物。取濾液1 mL，加入2. 5 mL 0.28 mol/L NaOH 溶液，混勻，于25 ℃左右放置10 min。加入0.75 mL 福林酚試劑，立即搖勻，于35 ℃左右反應(yīng)15 min，在660 nm 下測(cè)定其吸光值［9］。

1.5 實(shí)驗(yàn)組分組

以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，對(duì)篩選出的乳酸乳球菌菌株進(jìn)行分組，并分別與明串珠菌進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而得到不同組合的菌株，組合出不同蛋白水解能力的菌株。

1.6 菌株的共生性能測(cè)試

將選出的菌株以1%(v/v)接種量分別接種到121 ℃滅菌15 min 的M17 培養(yǎng)基中，再將各菌株以1∶1∶1∶1 的比例，按1%總的添加量接種到M17 肉湯培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)，每2 h 測(cè)1 次其在600 nm下的吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)。

將各菌株以1∶1∶1∶1 的比例，按1%總的添加量接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，記錄組合菌株的凝乳時(shí)間及其pH 值［10］。

1.7 高達(dá)干酪模型的制作工藝流程

制作8 個(gè)高達(dá)干酪樣品:其中1 個(gè)為對(duì)照樣品，對(duì)照樣品使用高達(dá)干酪專用發(fā)酵劑CHOOZIT RM 32，另外7 個(gè)為實(shí)驗(yàn)樣品，實(shí)驗(yàn)樣品中添加的乳酸菌按照2.7 的分組結(jié)果進(jìn)行，每一個(gè)干酪模型樣品用無(wú)抗菌素鮮牛乳(1 000 g)來(lái)制作。

鮮牛乳(1 000 g )→過(guò)濾殺菌(72 ～75 ℃，15 ～18 min)→冷卻(31 ～33 ℃)→添加氯化鈣(0.1 g/L)→加入發(fā)酵劑→產(chǎn)酸→添加凝乳酶(20 mL/100 L)→凝乳→切割凝塊→熱燙(39 ～40 ℃)→排乳清→凝塊破碎和鹽漬(浸漬在濃度為20% 的鹽水中)→成型→包裝15 ℃后熟(在食品級(jí)塑料袋內(nèi)真空包裝)。

1.8 高達(dá)干酪模型的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.8.1 色譜分析條件 程序升溫條件設(shè)置:進(jìn)樣后以60 ℃作為初始溫度保持5 min，以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持5 min，以8 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min，運(yùn)行總時(shí)間為47 min;色譜柱型號(hào)選用DB-5，進(jìn)樣口設(shè)置為250 ℃，離子源選擇EI，四級(jí)桿設(shè)置為150 ℃，傳輸線設(shè)置為280 ℃，載氣為He，選擇不分流進(jìn)樣模式，載氣流速1 mL/min，電離方式EI(70 eV)，質(zhì)量掃描范圍30 ～350 m/z。

1.8.2 固相微萃取SPME 條件［11］使用100 μm的PDMS 固相微萃取頭吸附時(shí)間為5 min。

1.8. 3 樣品處理 取樣品5 g，恒溫水浴時(shí)間60 ℃，吸附時(shí)間為30 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選及鑒定結(jié)果

菌株的篩選及鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株的篩選及鑒定結(jié)果Table 1 The result of screening and identification of the strains

2.2 明串珠菌的產(chǎn)香篩選

3 株明串珠菌的產(chǎn)香評(píng)定結(jié)果見表2。

由表2 可知，腸膜明串珠菌H 香味最佳。因此，選擇此菌株H 與乳酸乳球菌進(jìn)行組合。

表2 明串珠菌的產(chǎn)香篩選結(jié)果Table 2 The result of aroma producing screening of Leuconostoc

2.3 菌株的產(chǎn)酸速率

優(yōu)良干酪發(fā)酵劑菌株的選擇，產(chǎn)酸速度是關(guān)鍵。在干酪的加工過(guò)程中，發(fā)酵劑菌株一個(gè)重要的作用是分解乳糖產(chǎn)生乳酸，降低牛乳的pH 值，促進(jìn)凝乳酶凝乳，并且在干酪的成熟過(guò)程中，低pH 環(huán)境能夠有效抑制致病菌和腐敗微生物的生長(zhǎng)。

圖1 菌株產(chǎn)酸速率Fig.1 Acid producing activity of different strains

由圖1 可知，菌株A、B 產(chǎn)酸速度較快。24 h 后pH 最低。菌株的產(chǎn)酸速度影響干酪生產(chǎn)過(guò)程中牛乳的預(yù)酸化時(shí)間，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，可以加快牛乳預(yù)酸化的速度，酸的形成有利于發(fā)揮凝乳酶的作用和增加乳中鈣的溶解，以便于凝塊形成。

2.4 菌株在脫脂乳中的凝乳時(shí)間和產(chǎn)黏性能測(cè)定結(jié)果

凝乳時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)凝乳質(zhì)地和風(fēng)味形成有一定的作用，但會(huì)使生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng)。產(chǎn)酸快的菌株可以縮短凝乳時(shí)間，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，但是考慮到實(shí)際生產(chǎn)中，如果菌株產(chǎn)酸太快或者凝乳不好，將不利于干酪的生產(chǎn)［12］。

表3 乳酸乳球菌在脫脂乳中的凝乳時(shí)間和凝乳黏度Table 3 The curding rate of different Lactococcus lactis strains and viscosity of the curd formed in skim milk

由表3 可知，菌株A、B、C 凝乳相對(duì)較快，菌株A、B、D 黏度相對(duì)較高。選擇產(chǎn)黏能力適中的菌株是制備優(yōu)質(zhì)干酪的另一關(guān)鍵因素。

2.5 菌株的發(fā)酵性能

表4 為不同乳酸乳球菌的發(fā)酵牛乳性能。

表4 菌株的發(fā)酵性能Table 4 The fermentation performance of the strains

2.6 蛋白水解能力

由圖2 可知，發(fā)酵質(zhì)量濃度100 g/L 的脫脂乳，菌株蛋白水解能力A 和B 比較強(qiáng)。在干酪成熟過(guò)程中，發(fā)酵劑菌株將蛋白質(zhì)分解為多肽、胨、氨基酸以及其它無(wú)機(jī)和有機(jī)小分子物質(zhì)，對(duì)干酪風(fēng)味的形成有著重要作用。

圖2 乳酸乳球菌的蛋白水解能力測(cè)試結(jié)果Fig.2 The results of proteolytic ability of different strains

2.7 組合菌株生長(zhǎng)相互作用研究

以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，進(jìn)行分組后，與明串珠菌進(jìn)行結(jié)合，組合出了不同蛋白水解能力的菌株，見表5。以高達(dá)干酪專用發(fā)酵劑CHOOZIT RM 32 制作的干酪作為對(duì)照。

表5 對(duì)菌株的分組Table 5 The grouping result of strains

2.7.1 菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線和共同培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線 見圖3、圖4。

圖3 各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of different strains

由圖3 可知，菌株A、B、C、D 在6 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株E 和H 在4 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，之后生長(zhǎng)逐漸趨于平緩。

由圖4 可知，各菌株組合在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)速度均較緩慢，在培養(yǎng)16 h 后OD 值達(dá)到最高。因此，選取16 h 為各發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵終點(diǎn)。共同培養(yǎng)時(shí)菌株生長(zhǎng)量顯著高于相同條件下A、B、C 的生長(zhǎng)量，略低于E、H 的生長(zhǎng)量。

圖4 不同乳酸菌組合的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of different experimental groups

2.7.2 組合菌株產(chǎn)酸性能 見表6。

表6 組合菌株產(chǎn)酸性能測(cè)定結(jié)果Table 6 Acid producing result of different experimental groups

由表6 可知，菌株組合發(fā)酵脫脂乳約7 h 時(shí)使pH 值降低到4.3，而菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)只有菌株A、B經(jīng)過(guò)18 h 培養(yǎng)才能達(dá)到4.3 左右。因此，當(dāng)菌株共同生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)酸能力明顯強(qiáng)于菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)。

2.8 干酪中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

干酪成熟6 周后產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量見表7。菌株組合2 和組合3 制作的高達(dá)干酪可檢出的風(fēng)味物質(zhì)明顯多于對(duì)照組和其它實(shí)驗(yàn)組［13］，檢測(cè)到的胺類化合物含量比較低。酮、酸和酯類化合物是干酪風(fēng)味的主要來(lái)源，其中對(duì)干酪的特征風(fēng)味組分貢獻(xiàn)最大的化合物有7 種(即已烷、2-戊酮、丁酸乙酯、2-丁醇、庚酮、草酰乙酸、丁酸)，酮類物質(zhì)的風(fēng)味閾值相對(duì)較低，且在干酪樣品中的含量相對(duì)較高，因此對(duì)干酪的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。其中，3-羥基-2-丁酮表現(xiàn)為奶香味和脂肪味［14］。

表7 SPME-GC-MS 對(duì)不同組別的干酪模型中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果Table 7 The result of main flavor compositions of different experimental groups cheese model by SPME-GC-MS

3 結(jié)論

(1)以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，組合出7 組產(chǎn)酸能力強(qiáng)，同時(shí)蛋白水解能力不同差異的菌株組合，再與產(chǎn)香型的腸膜明串珠菌LM 79 進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)將乳酸乳球菌BD 3170、BD 2263、BD 164、BD 401、BD 732 和腸膜明串珠菌LM 79 共同培養(yǎng)時(shí)，各組合中菌株之間具有良好的互生作用。

(2)通過(guò)SPME-GC-MS 對(duì)各不同乳酸菌組合制作的高達(dá)干酪模型進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，與商業(yè)發(fā)酵劑制作的對(duì)照組干酪相比，發(fā)現(xiàn)組合2 和組合3 制作的高達(dá)干酪可檢出的風(fēng)味物質(zhì)中組分平衡結(jié)果最好，其中3-羥基-2-丁酮、2-戊酮、庚酮等風(fēng)味表現(xiàn)良好的風(fēng)味物質(zhì)含量較高，風(fēng)味表現(xiàn)不好的物質(zhì)如胺類的含量比較低。因此，乳酸菌組合2(BD 3170、BD 2263、BD 164、LM 79 按照1∶1∶1∶1的比例添加)和組合3(BD 2263、BD 164、BD 401、LM 79 按照1∶1∶1∶1 的比例添加)具備開發(fā)成高達(dá)干酪的發(fā)酵劑的潛力。

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