谷耀華，薛屏，李鵬，夏維濤

(寧夏大學(xué) 省部共建天然氣轉(zhuǎn)化國家重點實驗室培育基地 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

光學(xué)活性的手性醇與酯是精細有機化學(xué)品合成的重要原料，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［1-4］。(R，S)-3-羥基丁酸乙酯的兩種對映異構(gòu)體均是重要手性藥物合成的中間體，R-型異構(gòu)體用于治療青光眼藥物的合成，S-型異構(gòu)體用于合成昆蟲信息素、碳青霉素烯類抗生素等手性藥物，因此3-羥基丁酸乙酯單一對映體的制備備受學(xué)術(shù)和企業(yè)界的關(guān)注［5-6］。

物理拆分法以手性色譜柱作為分離柱，用高效液相色譜拆分能夠獲得3-羥基丁酸乙酯單一對映體［7］，但處理樣品的量極少，難以滿足化學(xué)合成中的需求。Lee 等［8］利用化學(xué)方法以鹽酸為催化劑，用乙醇醇解聚3-羥基丁酸乙酯，再用二氯甲烷萃取，制備了光學(xué)純(R)-3-羥基丁酸乙酯，但反應(yīng)條件苛刻，操作步驟繁瑣。生物催化技術(shù)合成手性化合物具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)勢［9-11］。于明安等［12］利用透性化處理的啤酒酵母細胞，借助于輔助底物乙醇和葡萄糖對3-羰基丁酸乙酯不對稱還原合成(S)-3-羥基丁酸乙酯進行了研究，在30 ℃中性溶液中，細胞濃度≥90 mg/mL 條件下反應(yīng)6 h，得到(S)-3-羥基丁酸乙酯的對映體過量值高于98%，產(chǎn)率94%。由于使用未固定化細胞作催化劑，反應(yīng)結(jié)束時催化劑難以分離回收，且無法實現(xiàn)連續(xù)化反應(yīng)。Fishman 等［13］利用固定化南極假絲酵母脂肪酶(CALB)催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯發(fā)生酯化反應(yīng)，得到(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過量值為96%，再用固定化CALB 在乙醇中對(R)-3-乙酸基丁酸乙酯進行醇解，得到了對映體過量值為96%的(R)-3-羥基丁酸乙酯，但固定化南極假絲酵母脂肪酶CALB 價格昂貴，使用量大、成本高。

氧化硅基介孔材料的出現(xiàn)為酶的固定化開辟了新的發(fā)展空間。氧化硅基介孔材料具有較大的比表面積和孔體積、易修飾的表面、良好的生物兼容性及穩(wěn)定性等優(yōu)點，是固定化酶的理想載體［14］。本文利用醛基功能化介孔材料制備固定化假單胞菌脂肪酶，并用于有機層中催化拆分(R，S)-3-羥基丁酸乙酯，研究了時間、溶劑和?；瘎┑确磻?yīng)條件對固定化酶催化轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)活性和對映選擇性的影響規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas sp Lipase，PSL，30 U/mg);(R，S)-3-羥基丁酸乙酯、1，3，5-三甲苯、乙酸乙烯酯均為化學(xué)純;正硅酸乙酯、乙酸酐、戊二醛、柱層析硅膠等均為分析純;正十二烷，色譜純;聚氧乙烯醚-聚氧丙烯醚-聚氧乙烯醚(EO20PO70EO20，P123)、3-氨丙基三乙氧基硅烷均為優(yōu)級純;乙酸異丙烯酯(99%)。

Micromeritics ASAP 2010 型物理吸附儀;Diamond TG/DTA 熱重-差熱綜合分析儀;GC-2010 型氣相色譜儀;WXG24 型圓盤旋光儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 介孔氧化硅泡沫MCF 的合成及其氨基化稱取2.0 g P123溶于75 mL 1.6 moL/L HCl 中，室溫下磁力攪拌至完全溶解。加入9.26 mL 三甲苯，攪拌均勻。加熱至38 ℃，加入4.7 mL 正硅酸乙酯，攪拌24 h，形成溶膠。溶膠轉(zhuǎn)入晶化釜中，于100 ℃晶化24 h。冷卻至室溫，濾出固體。干燥后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)68%濃硫酸于95 ℃處理24 h。抽濾，固體用去離子水洗滌至中性，再用無水乙醇進行索氏提取，得到介孔MCF。

取0.8 g MCF 于50 mL 的圓底燒瓶中，加入1.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和20 mL 甲苯，磁力攪拌均勻。于110 ℃油浴加熱，氮氣氣氛下反應(yīng)10 h。過濾，固體用10 mL 甲苯洗滌3 次，再用乙醇索氏抽提24 h，即得到氨基功能化樣品NH2-MCF。

1.2.2 NH2-MCF 戊二醛交聯(lián) 0.5 g NH2-MCF 加入到20 mL 含2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛的磷酸緩沖溶液(pH 8.0)中，室溫下攪拌1.5 h。過濾，固體用去離子水洗滌3 次。70 ℃真空干燥5 h，得GNH2-MCF。

1.2.3 固定化酶的制備 0.1 g G-NH2-MCF 分散在10 mL 異辛烷中，加入100 μL 0.1 moL/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻。加入10 mg 假單胞菌脂肪酶，于30 ℃恒溫水浴搖床振蕩4 h。用砂心漏斗抽濾，濾出固定化酶，并在真空干燥箱中室溫干燥后冷凍儲藏，用PSL/G-NH2-MCF 表示。

1.2.4 PSL/G-NH2-MCF 對3-羥基丁酸乙酯的催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng) 取1 mmol 3-羥基丁酸乙酯，2 mmol乙酸乙烯酯溶解在10 mL 甲苯中，加入100 mg固定化酶PSL/G-NH2-MCF 或10 mg PSL，40 ℃下反應(yīng)48 h。分離出固定化酶，結(jié)束反應(yīng)。

圖1 (R，S)-3-羥基丁酸乙酯的酶催化轉(zhuǎn)酯化拆分Fig.1 Transesterification resolution of (R，S)-ethyl-3-hydroxybutyrate catalyzed by lipase

反應(yīng)液用氣相色譜儀進行定量分析，氣化室溫度250 ℃，柱溫100 ℃，檢測器溫度250 ℃，氮載氣流速1.04 mL/min，分流比30∶1，柱前壓0.06 MPa，氫火焰檢測器。(R，S)-3-羥基丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化率C、(S)-3-羥基丁酸乙酯的對映體過量值eeS、(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的對映體過量值eeP和對映選擇性參數(shù)E 的計算如下［15］:

式中 ［S］S——(S)-3-羥基丁酸乙酯的摩爾濃度;

由于本課題研究具有一定的前瞻性，在理論上借鑒、參考有限，因此，課題研究的運作上缺少相關(guān)學(xué)科專家及課題專家的引領(lǐng)。課題組成員雖然在課題實施中學(xué)習(xí)了大量的理論，做了許多學(xué)習(xí)筆記，但是在理論基礎(chǔ)上還是比較欠缺的，研究的根基還很不扎實。在實施微課教學(xué)的實踐過程中，對教學(xué)中出現(xiàn)的問題難以在理論上得到很好的總結(jié)與提高。簡單地說，就是對課題研究如何行之有效地開展進行，還有待進一步探索研究，有時沒有達到預(yù)期的效果，理論與實踐還存在著較大的差距。這就需要我們在今后的教學(xué)實踐中不斷地反思、總結(jié)，進一步完善和提高。

［R］S——(R)-3-羥基丁酸乙酯的摩爾濃度;

［R］P——(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的摩爾濃度;

［S］P——(S)-3-乙酸基丁酸乙酯的摩爾濃度;

1.2.5 產(chǎn)物的分離和比旋光度的測定 反應(yīng)后的濾液用硅膠柱層析分離，柱徑比1 ∶10。用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)= 1∶9 的洗脫液淋洗，用薄層色譜進行檢測全部過程。當(dāng)3-乙酸基丁酸乙酯全部洗脫后，改用V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)= 1∶5 的洗脫液淋洗，直至3-羥基丁酸乙酯洗脫完畢，將3-乙酸基丁酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯的洗脫液分別進行減壓蒸餾，餾余液用甲苯稀釋至10 mL，裝入旋光管20 ℃測定其旋光度，比旋光度用[ ]α20D表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 G-NH2-MCF 的表征

2.1. 1 FTIR 分析 G-NH2-MCF 的紅 外光譜 見圖2。

圖2 G-NH2-MCF 的FTIR 譜圖Fig.2 FTIR spectra of G-NH2-MCF

由圖2 可知，1 715 cm－1的吸收峰歸于羰基 C O 的吸收峰，2 940 cm－1處較強吸收峰為戊二醛中—CH2— 的特征吸收峰［16］，1 652 cm－1吸收峰和1 690 ～1 630 cm－1吸收帶歸于氨基與醛基作用形成Schiff base 的特征吸收峰［17］，表明介孔氧化硅泡沫MCF 經(jīng)表面氨基化后戊二醛活化形成了富含醛基的G-NH2-MCF 載體。

2.1.2 N2吸附-脫附分析 G-NH2-MCF 的N2吸/脫附等溫線見圖3。

由圖3 可知，G-NH2-MCF 與MCF 和NH2-MCF三者的N2吸/脫附等溫線均居于IV 型。在P/P0=0 ～0.8 分壓段，吸附量隨著P/P0緩慢增加，在P/P0=0.8 ～0.9，吸附量陡增，產(chǎn)生突躍，這是N2在介孔內(nèi)產(chǎn)生的毛細管凝聚所致，吸附量的急劇增加表明它們均具有大孔結(jié)構(gòu)且孔徑比較均勻。之后N2分子吸附于外表面，曲線變化不大，較為平坦。MCF 經(jīng)氨基基團功能化及戊二醛活化后，G-NH2-MCF 仍保持了良好的大孔結(jié)構(gòu)，其最可幾孔徑為17.9 nm。

圖3 G-NH2-MCF 的N2吸附-脫附曲線Fig.3 N2 desorption-adsorption curves of G-NH2-MCF

G-NH2-MCF、NH2-MCF 和MCF 的比表面積、平均孔徑及孔體積列于表1。

表1 樣品的結(jié)構(gòu)性質(zhì)Table1 Structrual properties of samples

圖4 G-NH2-MCF 的孔徑分布Fig.4 Pore size distributions of G-NH2-MCF

由表1 可知，MCF 經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷表面修飾，再與戊二醛反應(yīng)形成的醛基介孔載體GNH2-MCF 比表面積為290.6 m2/g，平均孔徑和孔體積為16.5 nm 和1.66 cm3/g，G-NH2-MCF 借助自身的醛基和酶分子的氨基發(fā)生化學(xué)作用，從而使酶分子以共價鍵偶聯(lián)于G-NH2-MCF 載體(圖5)。脂肪酶的線尺寸在7 ～9 nm，G-NH2-MCF 的孔徑遠大于酶分子尺寸，這對于固定化過程酶的傳輸和固定化酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)均十分有利。

圖5 G-NH2-MCF 的制備和固定化酶示意圖Fig.5 Preparation of G-NH2-MCF and lipase immobilization

2.1. 3 TG-DTA 分析 G-NH2-MCF、NH2-MCF 和MCF 的TG-DTA 見圖6。

圖6 樣品的TG-DTA 曲線Fig.6 TG-DTA curves of the samples

由TG 曲線可見，在室溫～200 ℃，三者的失重率較小均在3%左右，主要為樣品表面吸附水和孔道吸附水的脫吸附。在300 ～550 ℃，NH2-MCF 失重率為12.3%，這是存在于其表面的氨基基團發(fā)生氧化反應(yīng)放熱引起的;G-NH2-MCF 熱重損失為18.4%，高于NH2-MCF，其原因是G-NH2-MCF 表面存在大量的醛基等有機基團。由DTA 曲線可知，GNH2-MCF 在250 ～400 ℃出現(xiàn)了較寬的放熱峰，歸為G-NH2-MCF 含有的有機基團燃燒放出大量熱所致，表明G-NH2-MCF 載體經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷和戊二醛功能化修飾存在大量醛基等有機基團。

2.2 PSL/G-NH2-MCF 催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)酯化拆分

分別取10 mg PSL 和0.1 g PSL/G-NH2-MCF 為催化劑，反應(yīng)結(jié)束濾出酶，反應(yīng)液經(jīng)氣相色譜進行定量分析，結(jié)果見表2。

由表2 可知，游離酶PSL 在40 ℃下催化反應(yīng)48 h，(S)-3-羥基丁酸乙酯的對映體過量值eeS為1.95%，(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的對映體過量值eeP為88.2%，這說明PSL 能夠?qū)⒉煌瑯?gòu)型的底物進行轉(zhuǎn)酯化拆分，主要是優(yōu)先選擇性地催化(R)-3-羥基丁酸乙酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。PSL 經(jīng)G-NH2-MCF 固定化后，其催化活性和對映選擇性有大幅提高，在相同條件下，PSL/G-NH2-MCF 催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)，(S)-3-羥基丁酸乙酯和(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的eeS和eeP分別為19.6%和87.6%，底物總轉(zhuǎn)化率為18.6%，E 值為18。

表2 PSL/G-NH2-MCF 與游離酶PSL 催化作用比較Table 2 Compared catalytic performance of PSL/G-NH2-MCF and free PSL

2.3 反應(yīng)時間對PSL/G-NH2-MCF 催化性能的影響

由表3 可知，隨著時間的延長，底物轉(zhuǎn)化率和eeS逐漸增加，但是eeP逐漸降低。主要是由于脂肪族消旋醇的兩個對映體生成相應(yīng)酯之間的自由能差別太小，快慢反應(yīng)催化速率差別不大，導(dǎo)致對映選擇性偏低，因此反應(yīng)時間的控制非常重要。反應(yīng)36 h時，eeS、eeP和 轉(zhuǎn) 化 率C 分 別 為9. 8%、95. 3% 和9.3%;反應(yīng)48 h 時，eeS、eeP和轉(zhuǎn)化率C 分別為19.6%，87.6%和18.3%，eeS和轉(zhuǎn)化率C 均有很大提高;若繼續(xù)延長反應(yīng)12 h，導(dǎo)致eeP下降至79.9%，反而不利于(R)-3-乙酸基丁酸乙酯純度的提高。綜合考慮化學(xué)產(chǎn)率和光學(xué)產(chǎn)率，選擇反應(yīng)時間為48 h較為適宜。

表3 反應(yīng)時間對PSL/G-NH2-MCF 催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯拆分的影響Table 3 Effects of reaction time on the resolution of(R，S)-ethyl-3-hydroxybutyrate catalyzed by PSL/G-NH2-MCF

2.4 ?；瘎SL/G-NH2-MCF 催化性能的影響

利用不同?；瘎┻M行轉(zhuǎn)酯化拆分，結(jié)果見表4。由表4 可知，?；瘎γ傅拇呋钚院蛯τ尺x擇性的影響非常顯著。用乙酸乙烯酯作為?；瘎?，反應(yīng)48 h 時，eeS、eeP和轉(zhuǎn)化率分別為19. 6%，87.6%和18.3%;相同反應(yīng)條件下，乙酸異丙烯酯為酰化劑，eeS、eeP和轉(zhuǎn)化率分別為14.1%，82.6%和14.6%，相對乙酸乙烯酯較低;乙酸酐作為酰化劑得到的對映體過量值和轉(zhuǎn)化率最低。因此，選擇乙酸乙烯酯較適宜。

表4 酰化劑對(R，S)-3-羥基丁酸乙酯拆分的影響Table 4 Effects of acylation reagent on the resolution of (R，S)-ethyl-3-hydroxybutyrate

2.5 反應(yīng)溶劑對PSL/G-NH2-MCF 催化性能的影響

由于體系中的水會在溶劑、酶、底物及產(chǎn)物之間進行分配，因而體系中溶劑的性質(zhì)對結(jié)合于酶分子的水量有直接影響。疏水性強的溶劑是較好的酶反應(yīng)介質(zhì)，由于疏水作用，使其所需較低水量即可滿足酶對水分的需求，有利于保持酶分子的必需水，使酶維持天然構(gòu)象。

表5 溶劑對PSL/G-NH2-MCF 對映選擇性的影響Table 5 Effects of solvent on the enantioselectivity of PSL/G-NH2-MCF

由表5 可知，固定化酶在不同極性的溶劑中有不同的催化活性，在極性較小的正庚烷中，eeP值為52.7%，隨溶劑極性的增大，在甲苯中eeP值達到87.6%，反應(yīng)的選擇性也相對較好;溶劑極性繼續(xù)增大，eeP值開始下降，在乙酸乙酯中下降至79.8%?？梢娺x擇甲苯溶劑較適宜。

2.6 底物摩爾比對PSL/G-NH2-MCF 催化性能的影響

由表6 可知，隨著酰化劑乙酸乙烯酯物質(zhì)量的增大，(S)-3-羥基丁酸乙酯的eeS和轉(zhuǎn)化率C 逐漸增大，當(dāng)摩爾比n(3-羥基丁酸乙酯)∶n(乙酸乙烯酯)=1 ∶1. 5 時，eeS、C 和對映選擇性參數(shù)E 分別為17.8%，15.6%和61，(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的eeP達到96.2%，繼續(xù)增大乙酸乙烯酯的用量，導(dǎo)致eeP和E 持續(xù)降低，PSL/G-NH2-MCF 的對映選擇性下降，不利于反應(yīng)進行。

表6 底物摩爾比對PSL/G-NH2-MCF 對映選擇性的影響Table 6 The effects of molar ratio of substrates on the enantioselectivity of PSL/G-NH2-MCF

3 結(jié)論

(1)PSL 催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)時，優(yōu)先催化底物中的(R)-3-羥基丁酸乙酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng);PSL 經(jīng)G-NH2-MCF 固定化后，其活性和對映選擇性均得到大幅提高。

(2)PSL/G-NH2-MCF 催化(R，S)-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)，是一種環(huán)境友好的制備單一構(gòu)型的3-羥基丁酸乙酯的新方法，在甲苯溶劑中，乙酸乙烯酯作酰化劑，反應(yīng)48 h，(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過量值eeS和(R)-3-乙酸基丁酸乙酯的對映體過量值eeP分別為17.8%和96.2%，底物的轉(zhuǎn)化率達15.6%。利用固定化酶進行二次拆分，以進一步提高單一對映體光學(xué)純度的研究，尚在進行中。

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